过表达马铃薯StuPPO9基因对烟草抗旱能力的影响

为鉴定马铃薯多酚氧化酶基因StuPPO9在干旱胁迫响应中的功能,本研究以利用农杆菌介导法获得的过表达StuPPO9基因的本氏烟草为材料,通过盆栽试验模拟自然干旱胁迫,对比转基因株系和空载转化(WT)烟草植株干旱胁迫0 d、3 d、6 d、9 d、12 d的生长形态,测定叶绿素、丙二醛、脯氨酸含量和抗氧化酶活性等生理指标以及抗旱相关基因的表达情况。结果表明,干旱处理后过表达株系叶片的相对含水量、叶绿素、脯氨酸含量以及SOD、POD活性均显著高于WT,而丙二醛含量则显著低于WT。RT-qPCR分析发现,活性氧(reactive oxygen species, ROS)清除系统基因SOD、POX, ABA生物合成基因NCED、RD29A,脯氨酸生物合成基因P5CS以及其他应激反应基因LEA、ADC、SAMDC等的表达量明显升高。本研究表明,StuPPO9基因增强了烟草植株对干旱的耐受性,为探明StuPPO9基因调控干旱胁迫响应的功能提供理论依据。

马铃薯多酚氧化酶新成员StuPPO9基因的分离鉴定及其过表达烟草遗传转化

多酚氧化酶是普遍存在于植物、动物、细菌及真菌中的一类由核基因编码的具有氧化酚类底物成醌类作用的金属铜蛋白酶,也是褐变过程中的关键酶类。本研究通过对马铃薯基因组数据库检索,发现马铃薯多酚氧化酶包含StuPPO1到StuPPO9中9个基因成员,其中StuPPO5-9为预测基因。同时StuPPO9是生物和非生物因素诱导表达的基因,然而其序列和功能未被验证。本试验以“大西洋”马铃薯叶片为试材,分别提取总RNA和gDNA,对该基因进行分离鉴定,同时对其进行过表达载体构建和转基因烟草转化,为后续基因功能验证提供技术支持。试验结果表明,StuPPO9基因大小为1884 bp,与XM_006347021一致性为98.4%,该基因含有一个内含子结构,与其他成员不同,它位于2号染色体上。该基因启动子可能被生物和非生物因素诱导激活。利用农杆菌介导的基因过表达技术,将该基因转入烟草中,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测获得了阳性株系。

马铃薯CRISPR/Cas9编辑多酚氧化酶StuPPO9基因的初探

马铃薯多酚氧化酶基因家族成员StuPPO9是晚疫病原菌诱导表达型基因。为研究StuPPO9基因在马铃薯抗晚疫病中的作用,本研究以马铃薯StuPPO9基因为靶基因,构建了StuPPO9基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体。利用农杆菌介导法,建立马铃薯CRISPR/Cas9基因编辑遗传转化体系,最终获得6株转基因阳性植株。进一步对靶位点序列进行测序分析,发现在转基因马铃薯的靶位点处检测到4种基因编辑方式。利用qPCR技术测定发生基因编辑的阳性植株中StuPPO9的表达情况,发现转基因植株StuPPO9(CRISPR)-2-4中,StuPPO9基因的表达受到明显抑制。以上结果表明,本研究已成功将CRISPR/Cas9基因编辑体系运用到马铃薯中,为马铃薯StuPPO9基因功能研究提供技术支持。