大肠杆菌毒素stx2eB-LTB-ST融合基因的构建与表达

利用PCR技术,从病原性大肠杆菌中扩增Stx2e及LT毒素B亚基的基因并扩增ST基因,用复式PCR技术获得了这三段基因的两种融合结构,一种是三段基因直接相连,另一种是在这三段基因之间加入适当的Linker序列。在这两种融合基因两端加入适当的酶切位点并分别与pMD18-T载体相连,酶切后以正确的阅读框插入pET28a载体的多克隆位点中,转入受体菌BL21(DE3)进行表达,得到两种约28 Ku的蛋白,表达的融合蛋白均以包涵体的方式存在,约占全菌蛋白表达量的30%,将包涵体初步提纯,为下游工作奠定了基础。

产志贺毒素大肠杆菌O138 stx2e基因的克隆与序列分析

目的构建产志贺毒素大肠杆菌O138stx2e基因重组质粒,并比较不同型Stx之间的区别。方法根据GenBank发表的stx2e序列设计了一对特异性引物,用PCR的方法扩增从临床分离到的产志贺毒素大肠杆菌O138的stx2e基因,将其克隆到pGEM-T载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经酶切和PCR鉴定,而后进行测序。并利用DNASIS序列分析软件对GenBank报道的O22菌株和噬菌体P27的stx2e和O138菌株的stx2e基因序列进行了比较分析,并对O138的stx2e氨基酸残基序列与stx1、stx2和O22菌株stx2e序列进行比较。结果所克隆的O138的stx2e与O22菌株和噬菌体P27的stx2e在碱基序列上同源性达到996%,O138的Stx2e与O22的Stx2e在氨基酸水平上其序列完全相同。Stx2e与stx2的同源性在85%以上,而stx2e与stx1的同源性只有42%左右。结论克隆了stx2e基因,为研究stx2e的结构和功能奠定了基础。

志贺氏菌样毒素Stx2e缺失突变株的构建及部分生物学特性的分析

水肿病是能由产志贺样毒素型大肠杆菌产生的Stx2e毒素引起的一种细菌传染病,对断奶仔猪有较高的致死率,常造成较大的经济。当前,Stx2e毒素影响病原菌与靶细胞之间的相互作用机制不明确,Stx2e基因缺失株作为后选疫苗的潜力有待确认。本研究中我们利用Red重组系统构建了大肠杆菌1522(serotype O139:K12:H1)和1525(serotype O157:H19)的Stx2e基因缺失株,并通过PCR检验,DNA测序手段以及Vero细胞毒性试验在细胞水平加以验证。研究发现,在同样的培养条件下,1522△Stx2e株的生长特性与原型株相比没有差异,其分解发酵糖类和氨基酸的能力也未发生改变,但是相较野生株,Stx2e基因缺失株粘附猪肠上皮细胞IPEC-J2的能力大幅度降低,可达30%。将表达K99菌毛操纵子基因克隆入1522△Stx2e中,该重组菌能够同时表达K99菌毛和自身的F18菌毛基因,且该重组株的粘附IPEC-J2细胞能力相较原型株增强近1倍。

猪水肿病毒素Stx2e的致Vero细胞凋亡作用

【目的】研究猪水肿病的致病因子志贺毒素2e(Shigatoxin2e,Stx2e)的致病机理。【方法】以AO/EB荧光染色法、琼脂糖凝胶电泳法和Western blotting等方法研究Stx2e对Vero细胞的致凋亡作用及其信号途径。【结果】从细胞形态学和染色质水平证明,Stx2e能诱导Vero细胞凋亡,并表现出时间和浓度依赖性;同时引起caspase-3表达量明显上调,Bax、caspase-9的表达量没有明显变化。【结论】Stx2e对Vero细胞的致凋亡作用主要通过膜受体通路引起,线粒体信号通路所起的作用较小。

猪水肿病大肠杆菌贵州分离株毒素Stx2e对Vero细胞的毒性作用

猪水肿病毒素即Ⅱ型志贺毒素变异体e亚型(Shiga toxin 2e,Stx2e)。采用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双荧光染色法和四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法,比较了从患水肿病猪粪便样品中分离的28株大肠杆菌所产志贺毒素对Vero细胞的毒性作用。结果显示,MTT比色法检测的细胞比活力与AO/EB染色法检测的正常细胞与早期凋亡细胞比率之和呈正相关。将28株菌株产生的Stx2e作用于Vero细胞,均能抑制Vero细胞的生长,并诱导Vero细胞的凋亡;其中8株病原菌所产Stx2e毒素对Vero细胞的毒性作用强于O157∶H7。这些毒素的毒力差异可能与其A亚基基因的结构变异有关。结果提示,贵州分离的产Stx2e大肠杆菌的毒力存在一定差异,其中部分菌株的毒力作用较强,应加强对养殖场仔猪的保护。

致猪水肿病大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在建立一种快速鉴定致猪水肿病大肠埃希菌的多重PCR检测方法。分别针对大肠埃希菌16SrDNA、志贺毒素Stx2eA亚基和菌毛F18ab A亚基保守序列设计合成3对特异性引物,优化多重PCR反应条件,并进行特异性和敏感性检测。结果显示,阳性对照菌株扩增产物大小分别为1 062、733和313bp。特异性和灵敏性检测结果表明,与肠炎沙门菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、支气管败血波氏杆菌和猪链球菌等猪常见致病菌均无交叉反应;菌体直接扩增法最低检出量为1 875CFU。利用建立的多重PCR检测方法对分离收集的128株大肠埃希菌进行鉴定,得到36株致猪水肿病大肠埃希菌,其中30株既有菌毛F18ab又产志贺毒素Stx2e,另外6株仅产志贺毒素Stx2e。结果表明,本试验所建立的多重PCR检测方法对致猪水肿病大肠埃希菌的快速诊断和流行病学调查具有一定的应用价值。

大肠杆菌毒力基因Colv、Stxs和HlyE的PCR检测(英文)

[目的]了解鸡源、猪源、食品源大肠杆菌Colv、Stxs(stx2、stx2e)、HlyE三种致病基因的存在情况。[方法]以44份鸡源、24份猪源、26份食品源的大肠杆菌菌株为试验材料,用PCR扩增方法分别对其Colv、Stxs(stx2、stx2e)和HlyE三种致病基因进行检测。[结果]检测的大肠杆菌菌株中,鸡源大肠杆菌菌株大肠杆菌素基因Colv检出率为25%,猪源大肠杆菌菌株大肠杆菌素基因Colv检出率为4.2%,食品源中没有检出;所有鸡源、猪源、食品源大肠杆菌菌株均没有检出类志贺毒素基因Stx2(Stx2e);鸡源大肠杆菌菌株溶血素E基因HlyE检出率为2.27%,猪源大肠杆菌菌株中没有检出,食品源大肠杆菌菌株溶血素E基因HlyE检出率为7.7%。[结论]大肠杆菌素基因Colv在鸡源和猪源大肠杆菌中有较高的携带率,溶血素E基因HlyE在鸡源和食品源大肠杆菌中也有一定程度的存在。

猪源大肠杆菌志贺样毒素2型突变体B亚基与LTB基因的融合与表达

猪水肿病的主要毒力因子是志贺样毒素的2型突变体(Stx2e),毒素的A亚基是有毒的酶活性单位,B亚基无毒,介导毒素与受体的结合。为了增加B亚基的免疫原性,采用重叠PCR将猪源志贺样毒素Ⅱ型突变体B亚单位(Stx2e B)连接至热敏肠毒素的B亚单位(LTB)成熟肽N末端,获得Stx2e B与LTB相连的融合蛋白基因Stx2e B-LTB。融合基因克隆到表达载体pQE30中,在IPTG的诱导下,融合基因在大肠杆菌中获得表达,表达量占细菌总蛋白的8%。融合蛋白的获得为猪水肿病基因工程亚单位疫苗的制备、猪水肿病的预防奠定了基础。

猪水肿病PCR快速检测试剂盒的研制

实验在大肠杆菌产生的志贺样毒素2型变异体(Shiga-like toxinⅡe,Stx2e)研究的基础上,设计了一对特异性引物,通过优化,建立了以PCR为基础,高效快速检测猪水肿病的PCR试剂盒。该试剂盒扩增的阳性条带为172bp的特异性DNA片段,最低检出菌体量为120CFU,在-20℃至少可保存12个月,重复性良好。应用猪水肿病PCR快速检测试剂盒对22份新鲜样本进行了检测,结果显示,其中的5个样本含Stx2e阳性大肠杆菌,PCR检测结果与剖检、细菌学和生化检验结果相一致。

仔猪水肿病的PCR快速诊断

根据GenBank发表的志贺毒素2型变异体（shiga-toxin 2e，Stx2e）的基因序列设计1对特异性引物，建立了一种检测STEC的PCR方法。通过对已知毒素类型参考菌株的扩增，证明所建立的PCR方法能够特异鉴定STEC。采集临床疑似仔猪水肿病未死亡病例（5例）的直肠棉拭子样品和死亡病例（15例）的十二指肠病料，接种LB肉汤于37℃增茵培养4～6h后，运用所建立的PCR方法对增菌培养物进行快速检测，结果表明有19例为STEC感染。通过与细菌分离后再鉴定的比较，证明了该诊断方法具有的速度快、栓出率高的特点，尤其适合于临床活体检测。

猪水肿病疫苗的研究进展

水肿病是猪生产中的常见病之一,造成了严重的经济损失。产志贺毒素大肠杆菌(STEC)是引起水肿病的病原菌,F18菌毛和Stx2e毒素是其重要的致病因子。STEC通过菌毛介导的黏附作用,定植于肠上皮细胞并产生毒素,引起微血管的病理学改变,表现出水肿病的临床症状。疫苗免疫仍然是防控水肿病的最佳途径。近年来,随着水肿病致病机制研究的深入,以及菌蜕疫苗、转基因植物疫苗、核酸疫苗等新型疫苗的试验性报道为水肿病的预防带来了新的认识和起点。本文概述了当前致病机制及STEC疫苗的国内外研究进展,对各类疫苗的优劣及试验研究情况进行了梳理,为今后疫苗研发提供参考。

产志贺毒素Ⅱ型变异体大肠杆菌LAMP检测方法的建立

为建立产志贺毒素Ⅱ型变异体(Stx2e)大肠杆菌的环介导恒温扩增(LAMP)检测方法,参照Gen-Bank中12条Stx2e序列和9条Stx2序列,针对Stx2e基因保守区域设计并合成4条引物,分别进行了反应条件优化、特异性试验、敏感性试验及模拟样品检测。结果显示,用所建立的LAMP方法对阳性样品扩增所得产物电泳后呈特征性梯状条带,阴性样品的扩增产物电泳后均无扩增条带。建立的LAMP方法对Stx2e+大肠杆菌的最低检出量为38CFU/管,敏感性高于PCR方法(3.8×103CFU/管)。LAMP和PCR对模拟样品检测结果的符合率为100%。该研究为仔猪水肿病的诊断和Stx2e+大肠杆菌的快速检测提供了新的方法。