岑软系列油茶无性系栽培品种配置研究

建立岑软系列油茶无性系的授粉配置模式,为油茶高产栽培提供重要的理论依据。本研究以岑软系列油茶无性系为对象,调查开花物候期、花粉量和花粉活力、无性系间授粉亲和程度。结果表明:9个岑软无性系开花物候期主要集中在11月上旬至12月下旬,根据盛花期分成早花组、中花组和晚花组,岑软ZJ11、岑软ZJ14和岑软362为早花组,岑软ZJ24、岑软3号、岑软22号和岑软24号为中花组,岑软2号和岑软11号则为晚花组。根据杂交授粉亲本盛花期一致的要求,栽培配置时不建议将岑软ZJ11、岑软ZJ14、岑软362与岑软2号、岑软11号搭配种植;各岑软无性系的单个花药花粉粒数量差异显著,大小范围为1186~4706个/花药,通过方差分析和系统聚类,将9个无性系的单花花粉粒总量分为3级,其中岑软22号和岑软11号最多,岑软3号、岑软ZJ14和岑软362最少;各无性系花粉活力也存在显著差异,开花3 d的变化范围为9.56%~100%,除岑软11号和岑软ZJ14开花3 d内花粉活力能保持在80%以上,其余无性系在开花第3天均表现明显的花粉活力变弱,常温贮藏的花粉授粉时应在开花2 d内完成;22个授粉组合中5个组合座果率达到100%,座果率达75%以上的组合有14个。综合考虑盛花期、花粉量和花粉活力等因素设计授粉组合,结合座果情况,在22个组合中最终筛选出了8个适宜的授粉组合分别为岑软ZJ14岑软ZJ11、岑软ZJ14岑软24号、岑软ZJ24岑软2号、岑软ZJ24岑软11号、岑软ZJ24岑软24号、岑软362岑软ZJ11、岑软362岑软ZJ24和岑软362岑软24号。本研究可为广西油茶种质创新提供理论基础。

棉花抗黄萎病相关基因筛选与亚克隆文库构建

以黄萎病菌诱导下差异表达的棉花抗病相关基因片段PR8为探针，利用杂交方法，对优质、抗病海岛棉品种Pima90—53BAC文库进行筛选。从30336个BAC克隆中筛选到含有PR8基因片段的4个阳性克隆，分别为127K13，128D14，169J3和178C5。用Sau3AI对其中的169J3克隆进行酶切，回收2—4kb的DNA片段并连接到载体pUCI18BamHI—BAP上，构建了含有该基因片段的亚克隆文库，共含有4224个克隆。经电泳检测，插入片段在1．3kb，平均为2kb。该亚克隆文库的构建为克隆PR8基因奠定了基础。

DNA序列分析鉴定HLA-DRB1新等位基因DRB1 1449

目的鉴定HLADRB1位点新等位基因。方法应用基因克隆和DNA测序技术对1例受检样本HLADRB1基因第2外显子(Exon2)作核苷酸序列分析,与已知等位基因序列比对并作血清学分型。结果基因组DNA和DNA克隆的测序结果一致;DRB1Exon2的核苷酸序列与已知等位基因序列均不相同,与同源性最高的HLADRB11432相比,存在4处碱基的改变;以Exon2的第1位碱基为记数起点,核苷酸71位C→>G,196位G→>A,244位T→>G和245位上G→>T,引起相应编码氨基酸28位上天门冬氨酸(Asp)→>谷氨酸(Glu),70位上精氨酸(Arg)→>谷氨酸盐(Gln),86位上缬氨酸(Val)→>氨基乙酸(Gly)。血清学分型结果表明新等位基因血清学特异性为DR14。结论被检标本HLADRB位点存在新等位基因,2005年2月WHOHLA命名委员会正式将其命名为HLADRB11449。

叶面喷施尿素对葡萄氮代谢相关基因表达的影响

本研究利用VitisEST数据库中EST序列片段结合RT-PCR方法克隆了与氮代谢相关的硝酸盐还原酶(NR)、亚硝酸还原酶(NiR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸脱氢酶(GDH)和天冬酰胺合成酶(AS)的基因,并对它们进行亚细胞定位分析。同时,采用半定量RT-PCR和荧光定量PCR法研究葡萄叶面喷施不同浓度尿素后5个基因的表达变化。结果表明,5个基因在葡萄幼叶中的表达水平显著高于老叶,说明叶面喷施尿素以喷布到幼叶对5个基因的表达水平影响显著;5个基因在不同时间段的表达水平差异不一致,但表达水平均高于对照,以0.3%和0.5%浓度的尿素对其影响明显;适当提高尿素水平既能提高氮代谢基因的表达水平,又能提高果实大小等果实指标,使其达到同步增加。喷施尿素6 h后,GS的表达量上升幅度明显高于其它基因,而NR在喷施尿素后48 h内一直保持着比较高的表达水平;NiR、AS表达量的变化趋势分别与NR、GS相一致,并且表现为NR﹥NiR,GS﹥AS。

WEHI164－C1细胞株检测TNF的MTS／PMS比色法的建立

本文用有限稀释法对ＷＥＨＩ１６４细胞进行了亚克隆，从１２株中筛选出一株对ＴＮＦ高度敏感的亚克隆细胞株ＷＥＨＩ－Ｃｌ。ＭＴｓ的还原产物具有良好的水溶性，ＭＴＳ／ＰＭＳ比色法与ＭＴＴ法相比较具有简便、快速的优点。我们首先将ＭＴＳ引入细胞毒的检测，用ＷＥＨＩ１６４－Ｃｌ亚克隆株建立了检测ＴＮＦ的ＭＴＳ／ＰＭＳ比色法。此方法不仅简便、快速．而且敏感度高（比常规Ｌ９２９细胞检测法敏感１０～１５倍）、特异性强（ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＰＨＡ、ＣｏｎＡ、ＬＰＳ对检测结果均无明显影响）。

含三倍体葡萄糖反应元件的质粒的构建及序列分析

用酚氯仿抽提法提取SD大鼠肝脏的基因组DNA,PCR扩增单倍体葡萄糖反应元件(glre)。分别用SacⅠ酶单酶切glre、pUC118载体后,连接、转化,PCR筛选出含三倍体glre的质粒并测序。结果PCR扩增出51bp的目的DNA片段,与文献报道的葡萄糖反应元件glre的大小一致;连接转化后,经PCR筛选出三倍体glre,序列分析显示其基因序列和Genbank数据库中的glre基因一致。以上结果表明构建成功含三倍体glre的质粒,为构建具双向调节的胰岛素分泌调控基因质粒奠定了基础。

高成瘤性前列腺癌细胞亚克隆细胞株的制备及其生物学特性的研究

目的:建立人前列腺癌LNCap细胞高成瘤性亚克隆细胞株并探讨其生物学特性。方法:慢病毒载体PGK-luciferase-GFP转染LNCap细胞,稳转株与Matrigel混合注入SCID小鼠皮下,反复消化法原代培养皮下瘤获得亚克隆细胞株,CCK8及Transwell实验检测细胞增殖及迁移力;用亲代LNCap细胞及亚克隆细胞皮下注射SCID小鼠成瘤,观察两组瘤体生长及大小,并用生物活体发光、病理及免疫组织化学检测瘤体情况。结果:与亲代LNCap细胞相比,亚克隆细胞的生长速度增快,迁移力增强,皮下瘤成瘤率增高,荧光信号强度增加,皮下瘤组织切片HE染色镜下可见核分裂相,免疫组织化学AR染色阳性。结论:制备的人前列腺癌亚克隆细胞株其恶性生物行为增加。

岑溪软枝油茶全同胞家系子代优良无性系选育

以岑溪软枝油茶(Cenxi soft-branch Camellia oleifera)全同胞家系林中初选的25株优良单株为材料,开展无性系测定试验,选育出岑软ZJ11、岑软ZJ14和岑软ZJ24三个油茶优良无性系。通过对三个无性系进行主要农艺性状遗传分析和产量差异比较,结果表明:无性系的鲜出籽率、干出籽率、种仁含油率和果油率的遗传力估计值h2分别为0.986、0.978、0.998和0.980,均接近1.0,表现出较高的遗传力。4~7年生平均产量、果油率在各无性系间均存在显著差异。选育出的3个无性系的早期产量和主要农艺性状均超过或优于对照良种岑软2号和岑软3号,其中每公顷产油量的对照遗传增益分别为4.72%~13.91%和5.49%~14.77%,果油率的对照遗传增益分别为13.15%~23.33%和7.81%~17.50%。

人肺表面活性物质结合蛋白A基因组克隆及亚克隆

【目的】 获得ＳＰＡ Ⅰ基因克隆及亚克隆，并进行序列分析，为研究ＳＰＡ 基因结构、表达调控、基因工程生产奠定基础。【方法】 以正常人血白细胞染色体ＤＮＡ 为模板，采用ＰＣＲ 及基因克隆技术，获得ｐＢＳ／ＳＰＡ Ⅰ克隆和ｐＵＣ１９／６３０ｂｐ 亚克隆，测序证实之。【结果】 测序结果显示，与已发表的ＳＰＡ Ⅰ序列相比，未发现基因突变。【结论】 证实获得的基因为ＳＰＡ Ⅰ。

人EGFR显性负性突变体真核表达载体的构建、蛋白表达及亚细胞结构定位

目的:构建人EGFR显性负性突变体真核表达载体pEGFPN1-DNEGFR,转染COS-7细胞,检测DNEGFR-EGFP的表达并进行亚细胞结构定位.方法:将RT-PCR(reverse tran-scription-polymerase chain reaction)方法扩增得到编码EGFR信号肽段、胞外区和跨膜区的cDNA,定向克隆至空载体pEG-FP-N1中,构建真核表达载体pEGFPN1-DNEGFR.经PCR扩增鉴定、双酶切鉴定、核苷酸序列测定以及生物信息学分析证明pEGFPN1-DNEGFR构建成功后,脂质体法转染体外培养的COS-7细胞,Western Blot检测DNEGFR-EGFP蛋白的表达,应用光谱激光扫描共聚焦显微镜对DNEGFR-EGFP亚细胞结构定位检测.结果:PCR扩增鉴定、双酶切鉴定、核苷酸序列测定以及生物信息学分析证实pEGFPN1-DNEGFR构建成功,并且Western Blot检测DNEGFR-EGFP蛋白的表达,光谱激光扫描共聚焦显微镜观察显示DNEGFR-EGFP蛋白主要定位于细胞膜.结论:成功构建人EGFR显性负性突变体真核表达载体,并在COS-7细胞胞膜上表达,为靶向EGFR显性负性策略在肿瘤基因治疗中的进一步研究打下基础.

大白菜CBL家族基因的鉴定和遗传进化分析

利用拟南芥中的CBL基因序列在GenBank中搜索比对大白菜的基因组序列和EST序列,鉴定出13个大白菜的CBL基因,分别命名为BrCBL1至BrCBL13,并对这些基因预测编码的蛋白序列进行特征分析和遗传进化比较分析,为进一步研究它们在大白菜逆境响应过程中的功能和利用它们进行大白菜抗逆分子育种奠定了基础。

中国沙棘人工林持久性对土壤水分状况的响应

在黄土高原丘陵沟壑区,土壤含水量是决定中国沙棘种群演替方向的主导因子。为探讨中国沙棘人工林持久性对土壤水分状况的响应规律及其克隆繁殖调节机制,采用不同土壤含水率梯度的样地数据,分析克隆繁殖能力与种群特征关系。结果表明:子株数量、克隆器官延伸能力和分枝强度与土壤含水率呈正相关,子株数量与克隆器官延伸能力、分枝强度呈正相关,种群增长率和稳定性随着子株数量的减少而下降。可以表明:土壤水分的减少,使中国沙棘的克隆繁殖和克隆扩散能力减弱,人工林的持久性也相应地下降。

B＊48与B＊1568难以应用SSP方法确定低分辨分型的分析

目的分析SSP方法难以确定B* 48与B* 1568低分辨分型的原因。方法应用基因克隆和DNA测序技术对受检标本HLA-B基因第1-3外显子(Exon1-3)作核苷酸序列分析,通过序列比对寻找SSP分型困难的原因。结果该标本HLA-B基因Exon1序列与B*4801Exon1序列完全相同,与已公布的B* 15Exon1序列相比,第5位碱基由G→T,第11位碱基由C→T,第44、45位碱基由GA→CG。Exon3序列则与B* 1568完全相同,按WHOHLA命名该标本为B* 1568。结论部分PCR-SSP引物序列涉及Exon1区域,但有些等位基因在此区域的序列并未公布,因此可能出现分型困难。分析SSP分型中引物发生的疑难问题,有助于提高HLA分型水平。

西尼罗I型病毒亚克隆的构建及其鉴定

目的构建西尼罗病毒基因组的cDNA亚克隆,为西尼罗病毒全长cDNA克隆的研发和应用打下基础。方法根据基因组中限制性酶切位点的分布设计4对引物,QIAamp RNA抽提试剂盒提取西尼罗病毒培养细胞BHK-21的总RNA,长片段RT-PCR技术扩增目的基因片段。将目的基因片段与pMD18-T载体进行连接,转化入感受态细胞E.coli DH5α,进行蓝白斑筛选后得到阳性克隆,将重组质粒进行PCR和测序鉴定。结果获得的目的基因片段经PCR和测序结果表明西尼罗病毒功能基因正确地克隆进入载体。结论成功获得西尼罗I型病毒功能基因的cDNA亚克隆,可应用于西尼罗病毒全长cDNA克隆的制备。

β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因亚克隆研究

β-1,3-1,4-葡聚糖酶（endo-1,3-1,4- -Glucanase）能专一性地分解大麦、燕麦淀粉质胚乳细胞壁的主要成份β-1,3-1,4-葡聚糖,产生还原糖,从而提高大麦和燕麦可利用糖源的含量,促进淀粉的释放。在啤酒酿造中,该酶在提高麦芽利用率,增加麦汁浸出量,加快糖化液和啤酒的过滤速度,避免啤酒浑浊等方面均有重要作用。最近,作者从Bacillus subtilis 1.88中分离到了含bgls基因的7.1kbEcoRI DNA片段,携带该片段的重组质粒pFG（表达出专一性降解大麦β-1,3-1,4-葡聚糖的酶活性。为了研究bgls基因的结构、功能和表达等特征,我们对bgls基因进行了亚克隆。

大肠杆菌头孢哌酮抗性基因亚克隆及序列初步分析

为了确定耐药质粒ｐ Ｆ Ｃ所编码β内酰胺酶衍化类型，用从临床分离出的大肠杆菌耐药质粒 ｐ Ｆ Ｃ头孢哌酮抗性基因，经分段亚克隆，构建重组质粒ｐ Ｆ Ｂ１、ｐ Ｆ Ｂ２、ｐ Ｆ Ｂ３ ，对上述 ３ 个重组质粒分别测序获得的抗性基因序列经 Ｉｎｔｅｒｎｅｔ互联网同源性检索，表明该抗性基因部分序列，与肺炎克雷伯氏菌编码超广谱β内酰胺酶 Ｔ Ｅ Ｍ５２ 的抗性基因序列存在高度同源性（９７％ ），提示ｐ Ｆ Ｃ头孢哌酮抗性基因所编码的 β内酰胺酶可能衍化自 Ｔ Ｅ Ｍ型。

大型模型克隆检测技术研究

模型克隆检测在软件维护、软件结构优化等方面具有重要价值和意义。首先综述了模型克隆的定义,接着对模型克隆的完整检测过程进行了详细划分和讨论,然后介绍了当前国际上最具代表性的两类大型模型克隆检测技术,最后对模型克隆检测的研究现状和亟需解决的问题进行了分析,并展望了该领域未来的研究方向。

曼氏血吸虫核糖体RNA基因(rDNA)的重组和亚克隆

利用ＤＮＡ重组技术，我们将二株曼氏血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｍａｎｓｏｎｉ）的核糖体ＲＮＡ基因（ｒＤＮＡ）ＢａｍＨⅠ／ＨｉｎｄⅢ非转录片段（ＮＴＳ）和部分基因编码区和非编码区片段，进行了进一步体外重组，组建了四种ｒＤＮＡ亚克隆。这四种亚克隆可用作ＤＮＡ探针研究和分析血吸虫抗性株和敏感株Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交中的限制性酶切片段长度多态性（ＲＰＬＰｓ）的含义。并且，可进一步探讨其在种、株、性别鉴别中的应用和研究与发育过程有关的基因组ＤＮＡ重组现象。

一种碱基精度的肿瘤基因组单体型异质性识别算法

针对肿瘤组织的异质性的子克隆解析,提出了一种通过多级子克隆的体细胞突变模式来识别单体型异质性的算法。该算法基于肿瘤组织的多文库测序数据提取文库特征和双末端读段约束,通过对体细胞突变位点的等位基因变异频率进行聚类估算出子克隆数目的一个先验;同时设计了一种拼接识别算法,通过遍历位点对应的读段来拼接单体型序列,拼接出的单体型序列的精度为碱基水平;采用后验概率的最大似然估计解出子克隆的个数、配比及演化关系。仿真实验表明,当基础文库满足一定测序覆盖度时,该算法对单体型异质性的识别精度可达到99%以上,能够取代目前数据分析中常用的两步法,且获得高精确的识别结果。

植物14-3-3基因的研究进展

文中对植物14-3-3基因的种类、表达及其亚细胞定位的研究进展进行了综述,并对其未来研究方向进行了展望。