J亚群白血病病毒NX0101株感染性克隆化病毒的构建及其致病性

采用PCR方法分3段扩增出J亚群白血病病毒NX0 10 1株的前病毒cDNA ,PCR产物经克隆后顺次连接,获得一个含有完整ALV J前病毒cDNA的重组质粒,命名为pALV J NX。将此质粒DNA纯化后转染鸡胚成纤维细胞,以针对ALV J的单克隆抗体JE9对转染后的细胞作间接免疫荧光反应,证明获得了具有感染性的病毒。测定原始野毒和分子克隆化病毒的半数组织感染量(TCID50 ) ,分别人工接种1日龄商品代肉鸡并隔离饲养17周。接种野毒组死亡率为2 6 % ,髓细胞瘤发病率为2 4 %。接种分子克隆化病毒组死亡率为2 2 % ,髓细胞瘤发病率为2 2 %。结果表明。

1株髓细胞瘤型J亚群禽白血病病毒感染性克隆的构建与病毒拯救

为构建髓细胞瘤型J亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV-J)SCGS-1株前病毒cDNA分子标记感染性克隆,根据SCGS-1全基因测序结果,分3段进行全序列PCR扩增,顺次连接至pUC19,构建SCGS-1株前病毒cDNA感染性克隆pUC-SCGS;通过重叠PCR方法对SCGS-1基因组进行沉默突变,在4 684位点引入SalⅠ位点,构建SCGS-1株分子标记感染性克隆pUC-△SCGS;以pUC-SCGS和pUC-△SCGS重组质粒转染CEF进行病毒拯救,并通过PCR、间接免疫荧光与双抗体夹心ELISA进行拯救病毒检测。结果显示,成功构建pUC-SCGS与pUC-△SCGS重组质粒,转染后盲传第3代、第4代细胞与上清中均检测到拯救病毒;间接免疫荧光与抗原ELISA方法分别在CEF细胞和上清中检测到ALV-J抗原。成功拯救获得分子标记ALV-J。

血管瘤病变型J亚群禽白血病病毒E元件缺失突变体的构建

为构建血管瘤病变型J亚群禽白血病病毒E元件缺失突变体病毒,本研究利用融合PCR方法将E元件缺失,获得含有缺失性突变体病毒前病毒全基因组的重组质粒pSCAU-HN-△E。将该重组质粒纯化后转染DF-1细胞,并连续传代,最终获得缺失病毒rSCAU-HN-△E。该毒株感染的DF-1细胞可被ALV-J特异性单克隆抗体JE9所识别,并且体外增殖性能稳定。该缺失性病毒的获得为E元件功能的研究奠定了基础。

鸡J亚群禽白血病病毒AH-J11株的全基因组感染性克隆构建

为探究鸡J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的致病机理,采用PCR方法分4段分别扩增出J亚群禽白血病病毒安徽分离株AH-J11的前病毒cDNA,PCR产物经克隆鉴定,酶切后顺次连接,获得含有完整ALV-J AH-J11株前病毒cDNA的重组质粒,命名为pSK-AH-J11。将AH-J11株全基因序列克隆至pBluescriptⅡSK(+)载体中,得到重组质粒pBl-AH-J11,并将其转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。通过间接免疫荧光试验,RT-PCR和Western blot检测,并经测序验证比对拯救前后病毒的gp85基因序列,结果均表明拯救出了1株重组J亚群禽白血病病毒(rALV-J)。本研究成功构建了鸡ALV-J的感染性克隆并救获了其重组病毒,为研究禽白血病的致病机理提供了良好的反向遗传操作技术平台。

J亚群禽白血病病毒分离株HLJ09SH01株感染性克隆的构建及其致病性研究

为构建J亚群禽白血病病毒(ALV-J)分离株的感染性克隆并鉴定其对蛋鸡和肉鸡致病力的差异,本研究从黑龙江地区分离鉴定一株ALV-J分离株HLJ09SH01,以其核酸为模板,采用PCR方法分3段扩增其前病毒cDNA,PCR产物经克隆酶切后依次连接,获得一个含有完整ALV-J前病毒cDNA的重组质粒,命名为pBlue-HLJ09SH01。将其转染DF-1细胞,进行病毒拯救。通过间接免疫荧光、禽白血病抗原试剂盒检测及反转录酶活性试剂盒检验,表明拯救的病毒为ALV-J,命名为rHLJ09SH01。将其分别人工接种11日龄蛋鸡和肉鸡鸡胚,孵育出壳后隔离饲养32周。致瘤性试验结果表明,rHLJ09SH01可以导致57.9%的蛋鸡发生肿瘤,83.3%的肉鸡发生肿瘤。表明该感染性克隆具有亲本病毒的致病性。

禽白血病病毒K亚群HB2018003株感染性克隆构建

为了获得背景明确清晰的禽白血病病毒K亚群(ALV-K)毒株,对地方性ALV-K毒株HB2018003采用酶切和同源重组两种方法进行感染性克隆构建及病毒拯救。使用PCR方法获得目的基因,经酶切、连接和同源重组后成功构建重组质粒Topo-003-ABC和Topo-003-K12,测序结果表明无任何突变,进而将重组质粒转染进鸡胚成纤维细胞(DF-1)中,经群特异性抗原P27 ELISA、PCR和间接免疫荧光(IFA)鉴定,结果均表明成功拯救出病毒,将其命名为R-rHB2018003(同源重组法)和E-rHB2018003(酶切法)。本研究为深入探讨ALV-K的致病机制奠定了基础。

B亚群禽白血病病毒GX14FF03株感染性克隆构建与拯救

为探究从灵山土鸡分离的携带J亚群禽白血病病毒(ALV)U3区片段的B亚群ALV(ALV-B)毒株GX14FF03的致病性,试验以GX14FF03毒株核酸为模板,采用PCR方法分2段扩增病毒的cDNA,PCR扩增产物经克隆、酶切后依次连接到pBluescriptⅡKS(+)质粒,最终获得一个含有ALV-B完整前病毒cDNA的重组质粒pBlue-GX14FF03。重组质粒转染DF-1细胞进行病毒拯救,拯救病毒在DF-1细胞盲传3代后收集细胞上清液保存于-80℃,细胞固定后用于间接免疫荧光检测。另取保存细胞上清进行ALV p27抗原检测。间接免疫荧光检测结果及ALV p27抗原检测结果全部为阳性。拯救病毒及亲本病毒接种DF-1细胞后进行体外复制能力测定,结果显示拯救病毒在1、3、5、7、9 d体外复制能力与亲本病毒基本一致,差异不显著(P>0.05)。上述结果表明病毒拯救成功,命名为rGX14FF03。

蛋鸡J亚群禽白血病病毒分离株SD1009株感染性克隆的构建与病毒拯救

为探究蛋鸡J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的致病机理,从山东省某鸡场送检的蛋鸡病料中分离鉴定出1株ALV-J,命名为SD1009株,采用PCR方法分3段扩增出SD1009株的前病毒cDNA,PCR产物经克隆酶切后顺次连接,获得1个含有完整ALV-J前病毒cDNA的重组质粒,命名为pBW-SD1009。全长测序及序列比对分析发现,近年来分离的ALV-J都存在缺失部分rTM和DR区的序列,缺失长度为205bp。通过外源基因嵌合的方式,将205bp嵌合进入,又获得了1个前病毒cDNA的重组质粒,命名为pBW-SD1009A205,将pBW-SD1009和pBW-SD1009A205分别转染DF1细胞,通过间接免疫荧光试验,禽白血病抗原试剂盒检测,反转录酶试剂盒检验,表明拯救出了2株病毒,分别命名为rSD1009和rSD1009A205。本研究成功构建了蛋鸡ALV-J的感染性克隆,并在序列分析的基础上,又构建了第2株补全缺失序列的感染性克隆,结果表明缺失部分rTM和DR区的序列,对病毒的拯救以及病毒的复制动力学无显著影响。