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Construction of Prokaryotic Expression Plasmid of Fusion Protein Including Porin A and Porin B of Neisseria Gonorrhoeae and Its Expression in E.coli
1
作者 廖芳 宋启发 万沐芬 《Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences)》 SCIE CAS 2004年第5期417-420,共4页
In order to provide a rational research basis for clinical detection and genetic engineering vaccine, plasmid pET-28a (+) encoding both Porin gene PIA and PIB of Neisseria gonorrhoeae was constructed and a fusion prot... In order to provide a rational research basis for clinical detection and genetic engineering vaccine, plasmid pET-28a (+) encoding both Porin gene PIA and PIB of Neisseria gonorrhoeae was constructed and a fusion protein in E.coli DE3 expressed. The fragments of PIA and PIB gene of Neisseria gonorrhoeae were amplified and cloned into prokaryotic expression plasmid pET-28a(+) with double restriction endonuclease cut to construct recombinant pET-PIB-PIA. The recombinant was verified with restriction endonuclease and sequenced and transformed into E.coli DE3 to express the fusion protein PIB-PIA after induced with IPTG. The results showed PIA-PIB fusion DNA fragment was proved correct through sequencing. A 67 kD (1 kD=0 992 1 ku) fusion protein had been detected by SDS-PAGE. It was concluded that the fusion protein was successively expressed. 展开更多
关键词 Neisseria gonorrhoeae porin B porin A prokaryotic expression plasmid recombinant fusion protein
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Cloning and Prokaryotic Expression of P23 Major Surface Protein Gene from Theileria sergenti 被引量:2
2
作者 李文学 李海峰 金清洙 《Agricultural Science & Technology》 CAS 2010年第5期96-100,共5页
[Objective] The aim was to study cloning and prokaryotic expression of P23 major surface protein gene of Theileria sergenti. [Method] A pair of specific primers was designed according to the sequence of P23 major surf... [Objective] The aim was to study cloning and prokaryotic expression of P23 major surface protein gene of Theileria sergenti. [Method] A pair of specific primers was designed according to the sequence of P23 major surface protein of T. sergenti (D84447).The P23 gene was amplified by PCR from genomic DNA of T. sergenti and cloned into pMD18-T vector to construct recombinant clonal vector pMD18-P23. Positive clones were identified by PCR screening and restriction digestion. A recombinant expression plasmid pGEX-4T-P23 was constructed by subcloning the cloned P23 gene into the linearized pGEX-4T-1 vector and transformed into E. coli BL21. After introduction by IPTG,the expressed fusion protein was identified by SDS-PAGE and Western-blotting. [Result] The cloned gene has a total length of 507 bp. Sequencing result showed that the nucleotide sequence of the cloned P23 gene shared 99.4% identity with that of P23 published in GenBank (D84447). The expressed fusion protein was 46 ku in molecular mass. Induction opportunity of zhours after culture inoculation was the best,the induction time of 6 h was the best,and induction temperature of 34 ℃ was the best as well,IPTG of 1 mmol/L had little effect on the expression. Western-blotting indicated that recombinant protein was recognized by specific antibody. [Conclusion] This study would lay a foundation for further research on the prevention and diagnose of T. sergenti. 展开更多
关键词 Theileria sergenti P23 major surface protein gene prokaryotic expression
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Construction of Prokaryotic Expression Vector of Mouse Nanog Gene and Its Expression 被引量:3
3
作者 LI Jun Lü Chang-rong DOU Lin DOU Zhong-ying 《Agricultural Sciences in China》 CAS CSCD 2007年第4期487-492,共6页
The aim of this study is to construct a prokaryotic expression vector of mouse Nanog gene and to express it in E. coli. A pair of primers was designed according to digestion sites in plasmid pGEX-KG and the Nanog gene... The aim of this study is to construct a prokaryotic expression vector of mouse Nanog gene and to express it in E. coli. A pair of primers was designed according to digestion sites in plasmid pGEX-KG and the Nanog gene sequence published by GenBank. The DNA fragment of 918 bp was amplified by polymerase chain reaction (PCR) from the pNA992 recombinant plasmid with Nanog gene, then cloned into pGEX-KG and transformed into the host E. coli strain TG Ⅰ. The sequence of the fragment was matched with the original sequence of pNA992. It indicated that fusion expression vector, pGEX-KG- Nanog, was constructed successfully. The pGEX-KG-Nanog plasmid was extracted from E. coli strain TG Ⅰ and was transformed into BL21(DE3) for expression. After induction by isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) at 37℃, the expression product of Nanog gene was identified by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and the expression condition was optimized. Nanog fusion protein was successfully expressed in the form of inclusion bodies. The molecular weight of the inclusion body was 63 kDa. Meanwhile, the optimum condition for the expression of Nanog fusion protein was induced with 0.8 mmol L^-1 IPTG for 5 h. The mouse Nanog gene was successfully expressed in E. coli, which laid a foundation for the purification of Nanog protein and for the preparation of polyclonal antibody. 展开更多
关键词 Nanog gene prokaryotic expression glutathione-S-transferase (GST) fusion protein MOUSE
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Construction and Expression of Prokaryotic Expression Vector of MPT-64 Gene
4
作者 Long PENG Linbo ZHANG 《Agricultural Biotechnology》 CAS 2014年第3期11-13,17,共4页
[Objective]Protective antigen gene MPT-64 was cloned from genomic DNA of Mycobacterium tuberculosis and transferred into prokaryotic competent cells for expression to obtain MPT-64 fusion protein.[Method]Based on the ... [Objective]Protective antigen gene MPT-64 was cloned from genomic DNA of Mycobacterium tuberculosis and transferred into prokaryotic competent cells for expression to obtain MPT-64 fusion protein.[Method]Based on the GenBank,primers were designed for amplification of MPT-64 gene,and the recombinant plasmid pET-32a-MPT-64 was constructed.The recombinant plasmid was expressed in prokaryotic expression vector to obtain fusion protein.[Result]Protective antigen gene MPT-64 was successfully cloned.The recombinant plasmid pET-32a-MPT-64 was obtained.MPT-64 fusion protein was successfully expressed.[Conclusion]This study laid solid foundation for the prevention,diagnosis,treatment of tuberculosis and the development of tuberculosis vaccines. 展开更多
关键词 Mycobacterium tuberculosis Protective antigen genes Secreted protein MPT64 prokaryotic expression fusion protein
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非洲猪瘟病毒p72蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备 被引量:4
5
作者 吴宏举 李潮 +6 位作者 郑南南 侯浩宇 陈寅龙 靳家鑫 孙爱军 杜永坤 张改平 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2023年第1期1-6,13,122,共8页
为了研发非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的免疫学诊断试剂,试验将ASFV B646L基因克隆至pET-30a(+)载体中构建表达载体pET-30a(+)-p72,利用大肠杆菌表达系统表达重组蛋白,采用SDS-PAGE分析诱导表达的大肠杆菌,以镍柱对... 为了研发非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的免疫学诊断试剂,试验将ASFV B646L基因克隆至pET-30a(+)载体中构建表达载体pET-30a(+)-p72,利用大肠杆菌表达系统表达重组蛋白,采用SDS-PAGE分析诱导表达的大肠杆菌,以镍柱对重组蛋白进行纯化,通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定纯化的重组蛋白。用纯化后的重组蛋白免疫Balb/c小鼠,通过细胞融合方法制备杂交瘤细胞。采用间接ELISA方法筛选并检测单克隆抗体,以Western-blot及IFA方法鉴定单克隆抗体的特异性,并通过Mouse Monoclonal Antibody Isotyping ELISA Kit鉴定单克隆抗体的亚型。结果表明:PCR扩增得到大小约为1 941 bp的B646L基因,并成功构建了表达载体pET-30a(+)-p72。诱导表达的大肠杆菌在72 ku处出现目的条带,纯化后的重组蛋白p72在72 ku处出现目的条带。筛选出4种单克隆抗体2C7D8、2E6D12、3B10E3、4G5E6,其效价在1∶100 000~1∶500 000之间,且4种单克隆抗体均能特异性识别真核及原核表达的p72蛋白。4种单克隆抗体的重链亚型均为IgG2b,单克隆抗体2C7D8和4G5E6的轻链亚型为Lambda, 2E6D12和3B10E3的轻链亚型为Kappa。说明利用大肠杆菌表达系统原核表达ASFV重组蛋白p72及制备相应的单克隆抗体是可行的。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p72蛋白 单克隆抗体 原核表达 细胞融合
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罗氏沼虾Doublesex基因的原核表达与蛋白纯化 被引量:1
6
作者 王瑞睿 马克异 《广东农业科学》 CAS 2023年第7期156-163,共8页
【目的】Doublesex属于DMRT基因家族成员之一,在控制性别特异性分化中起关键作用。克隆罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)Doublesex基因(MrDsx)的开放阅读框序列,构建重组质粒并诱导其表达,纯化获取罗氏沼虾重组蛋白MrDsx,可为后续... 【目的】Doublesex属于DMRT基因家族成员之一,在控制性别特异性分化中起关键作用。克隆罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)Doublesex基因(MrDsx)的开放阅读框序列,构建重组质粒并诱导其表达,纯化获取罗氏沼虾重组蛋白MrDsx,可为后续开展罗氏沼虾MrDsx基因的功能研究提供基础数据。【方法】基于罗氏沼虾MrDsx的开放阅读框序列,通过特异PCR产物与表达载体pET-32a(+)连接,获得重组质粒pET-32a-MrDsx,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,构建罗氏沼虾MrDsx基因的原核表达细胞。利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对阳性转化细胞进行诱导表达,并以SDS-PAGE电泳,Western blot和质谱分析检测诱导表达的重组蛋白。【结果】以罗氏沼虾性腺cDNA为模板,利用MrDsx基因的特异引物,PCR扩增获得了约660 bp大小的单一DNA条带。经测序确认为MrDsx基因的ORF序列。重组质粒pET-32a-MrDsx转化后的感受态细胞经IPTG在37℃条件下诱导4 h后获得罗氏沼虾重组蛋白MrDsx。当IPTG终浓度为0.1~0.5 mmol/L时,重组蛋白MrDsx的表达量可达到峰值。可溶性分析显示,重组蛋白MrDsx主要以包涵体形式表达,经8 mol/L尿素溶解、Ni柱纯化及透析复性后,SDS-PAGE电泳和Western blot检测发现重组蛋白的相对分子量约55 kD,且条带单一,表明重组蛋白MrDsx能被鼠抗His-tag单克隆抗体特异性识别。质谱分析结果显示,片段化肽段与理论的氨基酸序列相符,匹配度达到100%。【结论】成功获得了MrDsx基因原核表达的重组质粒pET-32a-MrDsx。诱导表达的重组蛋白经溶解、纯化及复性后,可形成高纯度的活性罗氏沼虾MrDsx重组蛋白,为后续开展罗氏沼虾MrDsx基因的功能研究、互作蛋白的筛选和性别调控机制的解析提供初步依据。 展开更多
关键词 罗氏沼虾 DOUBLESEX 原核表达 蛋白免疫印迹 重组蛋白 透析复性 质谱分析
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新型冠状病毒RBD蛋白原核表达及多克隆抗体的制备 被引量:3
7
作者 彭晓燕 陆盼盼 胡祖权 《生物技术进展》 2023年第1期102-106,共5页
为原核表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(简称新型冠状病毒,severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2,SARS-CoV-2)S蛋白受体结合域(receptor binding domain,RBD)并制备多克隆抗体,利用基因克隆技术将RBD基因连接到原核表达载... 为原核表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(简称新型冠状病毒,severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2,SARS-CoV-2)S蛋白受体结合域(receptor binding domain,RBD)并制备多克隆抗体,利用基因克隆技术将RBD基因连接到原核表达载体pGEX-6p-1和pET-32a(+)上,电转化至大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞,利用优化后的表达条件大量表达重组蛋白,经亲和层析纯化后通过SDS-PAGE检测蛋白的表达情况。利用GST-RBD融合蛋白作为免疫抗原免疫小鼠制备多克隆抗体,ELISA和Western blot分析抗血清的效价和特异性。PCR鉴定和序列测定结果显示,成功构建了重组载体pGEX-RBD和pET-RBD,在大肠杆菌中实现了GST-RBD和RBD-His融合蛋白的可溶性高效表达。研究获得的多克隆抗体的滴度达到约1∶3000,并具有良好的结合特异性。原核表达的可溶性新型冠状病毒RBD重组蛋白具有良好的免疫原性,为后续制备基因工程抗体奠定了实验基础。 展开更多
关键词 新型冠状病毒 受体结合域 原核表达 融合蛋白 多克隆抗体
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雄激素受体基因各功能域片段的原核表达与功能鉴定
8
作者 张雨琪 丁明珠 +3 位作者 吴金凤 郑海香 张磊 王星 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2023年第2期219-224,共6页
目的系统构建雄激素受体(AR)野生型全长和4个功能域截短体的原核表达质粒,Western blot与凝胶迁移(EMSA)实验鉴定各融合蛋白及其功能。方法基于pGEX-4T-1载体,构建AR全长及各功能域的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合表达重组质粒。应用异丙... 目的系统构建雄激素受体(AR)野生型全长和4个功能域截短体的原核表达质粒,Western blot与凝胶迁移(EMSA)实验鉴定各融合蛋白及其功能。方法基于pGEX-4T-1载体,构建AR全长及各功能域的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合表达重组质粒。应用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对重组质粒进行诱导表达,确定各重组蛋白的最佳参数。分别用AR内源性抗体和GST标签抗体进行Western blot鉴定,分析诱导前、诱导后细菌裂解液中的目的蛋白,并利用谷胱甘肽琼脂糖树脂进一步纯化。将纯化后蛋白与病毒荧光探针进行孵育,复合物于非变性凝胶中电泳检测纯化蛋白功能。结果成功构建了AR全长和3个功能域截短体的原核表达质粒。PCR和双酶切鉴定均显示在各插入片段大小相符处出现阳性条带,且测序结果与NCBI GenBank标准株比对一致。其中,96 ku GST-AR-NTD+DBD与86 ku GST-AR-NTD两个融合蛋白得以成功表达及后续纯化。纯化蛋白可与病毒基因组DNA直接结合。结论来源同一基因序列的AR截短体重组质粒原核表达条件不同,纯化后的AR蛋白可用于深入了解AR各功能域与其他分子间的直接相互作用机制。 展开更多
关键词 雄激素受体 原核表达 GST融合蛋白 功能域突变体
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汉滩病毒M、S基因部分片段在大肠杆菌中的融合表达 被引量:10
9
作者 罗雯 徐志凯 +6 位作者 阎岩 吴兴安 张芳琳 刘勇 赵茜 白文涛 王海涛 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第2期115-117,共3页
目的在大肠杆菌中融合表达含主要抗原位点的汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与NP片段。方法将汉滩病毒76118株M基因编码G1的片段与S基因编码区5′端约0.7kb的片段连接,克隆入pGEX4T2,构建嵌合基因原核表达载体pGEX4T2G1S0.7,并在大肠杆菌... 目的在大肠杆菌中融合表达含主要抗原位点的汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与NP片段。方法将汉滩病毒76118株M基因编码G1的片段与S基因编码区5′端约0.7kb的片段连接,克隆入pGEX4T2,构建嵌合基因原核表达载体pGEX4T2G1S0.7,并在大肠杆菌XL1Blue中,诱导GSTG1S0.7融合蛋白的表达。表达产物用ELISA和Westernblot进行鉴定。结果成功地构建了嵌合原核表达载体pGEX4T2G1S0.7。经IPTG诱导后,ELISA活性测定结果表明,该融合蛋白可与抗汉滩病毒NP及糖蛋白的mAb特异性结合。Westernblot结果显示,诱导出相对分子质量Mr大于1×105的G1S0.7与GST的融合蛋白。结论获得具有特异性结合活性的融合蛋白GSTG1S0.7,为汉滩病毒基因工程疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 汉滩病毒 原核表达 融合蛋白 大肠杆菌
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鸡白细胞介素-18基因的原核表达及多克隆抗血清的制备 被引量:11
10
作者 刘胜旺 潘蔚绮 +2 位作者 孔宪刚 李广兴 夏春 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期427-430,共4页
将编码鸡白细胞介素 - 18(interleukin- 18,IL- 18)成熟蛋白的基因亚克隆至原核表达载体 p PROEXTMHT中 ,构建重组质粒并进行确证性序列测定。然后将重组质粒转化大肠杆菌 DH5α并用 IPTG于 37℃诱导培养。表达的融合蛋白主要以包涵体... 将编码鸡白细胞介素 - 18(interleukin- 18,IL- 18)成熟蛋白的基因亚克隆至原核表达载体 p PROEXTMHT中 ,构建重组质粒并进行确证性序列测定。然后将重组质粒转化大肠杆菌 DH5α并用 IPTG于 37℃诱导培养。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在 ,目的蛋白表达量占菌体蛋白的 30 %。 SDS- PAGE和 Western blot分析显示 ,表达的鸡 IL-18融合蛋白相对分子质量约为 2 30 0 0。包涵体被 6 mol/ L 盐酸胍裂解后 ,通过镍离子亲和树脂进行了纯化。用所获得的重组鸡 IL- 18融合蛋白及其纯化产物经 3次肌肉注射豚鼠 ,制备豚鼠抗鸡 IL- 18多克隆抗血清 ,并用琼脂扩散试验多克隆抗血清进行了证明。本试验成功的原核表达、纯化了鸡 IL- 18融合蛋白 ,并制备了抗鸡 IL- 18多克隆抗血清 ,为下一阶段关于鸡 IL - 展开更多
关键词 鸡白细胞介素-18基因 原核表达 多克隆抗血清 重组蛋白 制备 细胞因子
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普通小麦中α-醇溶蛋白基因(GQ891685)的克隆、表达及品质效应鉴定 被引量:12
11
作者 李敏 高翔 +3 位作者 陈其皎 董剑 赵万春 王明霞 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第23期4765-4774,共10页
【目的】利用E.coli体外大量高效表达带有1个额外半胱氨酸残基的α-醇溶蛋白,经Ni+-NTA柱纯化获得目标蛋白,通过氧化-还原反应将其整合到基础面粉中,利用粉质仪研究其对面团流变学特性的影响,以确定该基因表达产物的加工品质效应。【方... 【目的】利用E.coli体外大量高效表达带有1个额外半胱氨酸残基的α-醇溶蛋白,经Ni+-NTA柱纯化获得目标蛋白,通过氧化-还原反应将其整合到基础面粉中,利用粉质仪研究其对面团流变学特性的影响,以确定该基因表达产物的加工品质效应。【方法】根据α-醇溶蛋白基因编码区保守序列设计引物,从小麦品种陕253中克隆到1条含α-醇溶蛋白基因编码区的目的片段,长度为1243bp(GenBank登录号GQ891685),构建了该基因的原核表达载体pET32a-S253-Agli,在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中经IPTG诱导表达,对表达的蛋白进行亲和层析及低温冷冻干燥回收、纯化,通过微量掺粉试验,在4g粉质仪上测定其对面团流变学特性的影响。【结果】该基因片段包含900bp的完整编码序列及部分5′-调控元件;Uniq domainⅡ区第6位氨基酸密码子C→G的转换,导致丝氨酸Ser→半胱氨酸Cys的变化,这1额外的半胱氨酸将有可能参与形成1个分子间二硫键;用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE及Western blotting检测,证实融合蛋白表达成功并主要以包涵体形式存在;粉质结果表明,添加S253-Agli蛋白虽然能够增加面团的带宽及机械耐力系数,却因显著缩短面团稳定时间及形成时间而对面团的粉质参数产生了总体的负面效应。【结论】具有1个额外半胱氨酸残基的α-醇溶蛋白GQ891685增强了面筋弹性,但降低了面筋强度。 展开更多
关键词 陕253 α-醇溶蛋白 融合蛋白 原核表达 品质效应
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猪丹毒丝菌C43311株spaA基因N端免疫保护区的克隆和表达 被引量:11
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作者 吾鲁木汗·那孜尔别克 刘祝祥 +2 位作者 李科 陈义光 恩特马克·布拉提白 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期207-212,共6页
采用PCR从猪丹毒丝菌C43311株基因组中扩增出编码表面保护性抗原A的spaA基因片段,将其克隆到pMD18-T载体并对插入片段进行测序。用spaA基因N端免疫保护区(spaA-N)的特异引物从重组质粒pMD18-spaA中扩增得到spaA-N片段,将其定向插入原核... 采用PCR从猪丹毒丝菌C43311株基因组中扩增出编码表面保护性抗原A的spaA基因片段,将其克隆到pMD18-T载体并对插入片段进行测序。用spaA基因N端免疫保护区(spaA-N)的特异引物从重组质粒pMD18-spaA中扩增得到spaA-N片段,将其定向插入原核表达载体pGEX-6p-2中,构建重组表达质粒pGEX-spaA-N,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达融合蛋白GST-SpaA-N,用SDS-PAGE和Western印迹检测表达产物。测序结果表明spaA基因片段大小为1881bp,与已报道的不同血清型菌株spaA基因的核苷酸序列比较,核苷酸序列同源性在93%~99%之间。SDS-PAGE结果显示表达蛋白约为64kDa,与预期的大小相近。Western印迹检测结果表明,表达的融合蛋白GST-SpaA-N能与C43311株SpaA蛋白的抗血清发生特异性反应,证明原核融合表达蛋白具有免疫反应性。 展开更多
关键词 猪丹毒丝菌 spaA基因 融合蛋白 免疫反应性 原核表达
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pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒的构建及PEP-1-CAT融合蛋白的表达与纯化 被引量:12
13
作者 姚玲玲 王家宁 +1 位作者 黄永章 郭凌郧 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第9期1319-1325,共7页
目的构建pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒,并表达、纯化得到融合蛋白PEP-1-CAT,为防治与氧化应激有关的疾病奠定基础。方法设计并合成两端分别带SalI和BglII酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长cDN... 目的构建pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒,并表达、纯化得到融合蛋白PEP-1-CAT,为防治与氧化应激有关的疾病奠定基础。方法设计并合成两端分别带SalI和BglII酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长cDNA。将扩增的CATcDNA与dATP反应,利用TaqDNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CATcDNA的3'末端加“A”并纯化,然后应用TA克隆策略将纯化后的CATcDNA插入至中间载体pGEM-TEasyVector中得到pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核苷酸,两端分别引入NdeI和XhoI酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经SalI-BglII和XhoI-BamHI双酶切,利用同尾酶(SalI与XhoI,BglII与BamHI)能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CATcDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。将鉴定正确的pET15b-PEP-1-CAT重组质粒转化BL21(DE3),用IPTG诱导目的蛋白表达。然后利用重组蛋白N端的组氨酸“标签”(His-tag)对其进行金属螯合亲和层析纯化。结果测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CATcDNA序列一致。SDS-PAGE和Westernblot结果表明,pET15b-PEP-1-CAT在E.coli中获得可溶性高表达,经Ni2+-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的融合蛋白PEP-1-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性,活性值为77.15U/g。结论成功构建了原核表达载体pET15b-PEP-1-CAT,并经表达、纯化得到可以天然活性形式穿透细胞的重组过氧化氢酶蛋白,从而为防治心肌缺血再灌注损伤等与氧化应激有关的疾病奠定了基础。 展开更多
关键词 原核表达 过氧化氢酶 TA克隆 同尾酶 融合蛋白
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小鼠Nanog基因原核表达载体的构建及表达 被引量:11
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作者 李军 吕长荣 +1 位作者 窦琳 窦忠英 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期373-378,共6页
【目的】构建小鼠Nanog基因原核表达载体并进行表达,以期得到大量GST融合蛋白。【方法】根据Gene Bank中的Nanog序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物,以含有Nanog基因片段的pNA992重组质粒为模板,经PCR扩增出918 bp的DNA片段。将所得... 【目的】构建小鼠Nanog基因原核表达载体并进行表达,以期得到大量GST融合蛋白。【方法】根据Gene Bank中的Nanog序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物,以含有Nanog基因片段的pNA992重组质粒为模板,经PCR扩增出918 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接,转化TGⅠ大肠杆菌,筛选阳性克隆,其扩增片段测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pGEX-KG-Nanog已构建成功。提取pGEX-KG-Nanog质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定,并优化其表达条件。【结果】在大肠杆菌中获得Nanog基因融合表达,主要以包涵体形式存在;融合蛋白的分子量为63 kD;以IPTG终浓度为0.8 mmol.L-1,诱导5 h后融合蛋白产量最高。【结论】小鼠Nanog基因在大肠杆菌中获得了高效表达,为今后Nanog蛋白的多克隆抗体制备奠定基础。 展开更多
关键词 NANOG基因 原核表达 GST融合蛋白 小鼠
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O型口蹄疫病毒VP1蛋白的原核表达及功能鉴定 被引量:5
15
作者 杨苏珍 张改平 +5 位作者 鲍登克 乔松林 万博 樊剑鸣 职爱民 李学伍 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2009年第6期11-14,共4页
为获得具有免疫原性的FMDV VP1蛋白,以O型FMDV重组质粒PMD18T-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDVVP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体,命名为pET-VP1,经PCR和测序鉴定后,用IPTG诱导表达,收集诱导的... 为获得具有免疫原性的FMDV VP1蛋白,以O型FMDV重组质粒PMD18T-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDVVP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体,命名为pET-VP1,经PCR和测序鉴定后,用IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析。结果显示,在分子量约为45 ku处有1条明显的蛋白条带,且能被口蹄疫阳性血清识别,表达产物通过包涵体纯化后用透析法复性;ELISA检测结果显示,所复性的蛋白具有较高的活性。结果表明,FMDV VP1蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为开发诊断制剂和疫苗的研制打下基础。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 VP1基因 原核表达 蛋白复性
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人金属硫蛋白MT-2a的原核表达、纯化及其抗血清的制备 被引量:6
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作者 周敏 杨芳 +4 位作者 贺智敏 刘孝荣 陈主初 孙麟 孙宇 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期530-532,共3页
目的:在大肠杆菌中表达人金属硫蛋白(MT)-2a与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白,并制备兔抗MT-2a抗血清。方法:人MT表达菌株BL21/GST-MT-2a经IPTG诱导、超声裂解及GlutathioneSepharose4B亲和层析纯化后,以可溶性融合蛋白GST-MT-2a免疫... 目的:在大肠杆菌中表达人金属硫蛋白(MT)-2a与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白,并制备兔抗MT-2a抗血清。方法:人MT表达菌株BL21/GST-MT-2a经IPTG诱导、超声裂解及GlutathioneSepharose4B亲和层析纯化后,以可溶性融合蛋白GST-MT-2a免疫新西兰大白兔,制备抗血清。用双向凝胶免疫扩散和ELISA检测抗血清的效价,用Westernblot检测抗血清的特异性。结果:经诱导表达及亲和层析纯化,每L菌液可获得可溶性融合蛋白GST-MT-2a38mg。以此融合蛋白免疫新西兰大白兔制备的抗血清,双向免疫扩散效价>1∶256,ELISA效价>1×10-7。Westernblot检测证明抗血清的特异性良好。结论:人MT-2a在大肠杆菌中得到高效表达,以纯化的GST-MT-2a可溶性融合蛋白免疫家兔得到高效价、高特异性的抗血清,为进一步研究MT-2a蛋白的生物学功能提供了重要的制剂。 展开更多
关键词 金属硫蛋白 原核表达 融合蛋白 抗血清
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瑞替普酶融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化及其复性 被引量:4
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作者 孙石静 张新元 +2 位作者 孙雄华 廖建民 沈子龙 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期363-367,共5页
目的:为优化瑞替普酶(reteplase,r-PA)在大肠杆菌中的高效融合表达的条件,并提高其复性率。方法:通过改变诱导时间和温度、诱导剂浓度、培养基pH值及氨苄青霉素(Amp)浓度等条件,利用SDS-PAGE分析以上条件的改变对表达产物产量的影响。... 目的:为优化瑞替普酶(reteplase,r-PA)在大肠杆菌中的高效融合表达的条件,并提高其复性率。方法:通过改变诱导时间和温度、诱导剂浓度、培养基pH值及氨苄青霉素(Amp)浓度等条件,利用SDS-PAGE分析以上条件的改变对表达产物产量的影响。运用金属螯合层析对融合蛋白进行纯化和复性。结果与结论:LB培养基pH值为6,Amp浓度为100μg/mL,乳糖浓度为5 mmol/L的条件下39℃诱导4 h可获得高效表达的r-PA融合蛋白,其表达量占全菌蛋白的70%,其产物主要以包涵体形式存在。融合蛋白运用金属螯合层析一步纯化复性,其复性率可达10%,比活为55.7 U/μL。 展开更多
关键词 瑞替普酶 融合蛋白 诱导表达 优化 复性
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梨小食心虫化学感受蛋白cDNA的克隆、序列分析及原核表达 被引量:14
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作者 张国辉 刘彦飞 仵均祥 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期668-675,共8页
为了研究梨小食心虫Grapholita molesta化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)在化学感受系统中的作用,本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆到一条梨小食心虫化学感受蛋白的全长cDNA序列,命名为GmolCSP(GenBank登录号:JQ821389)。序列... 为了研究梨小食心虫Grapholita molesta化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)在化学感受系统中的作用,本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆到一条梨小食心虫化学感受蛋白的全长cDNA序列,命名为GmolCSP(GenBank登录号:JQ821389)。序列分析表明,GmolCSP开放阅读框序列为384bp,编码127个氨基酸残基,预测N末端含有18个氨基酸组成的信号肽序列,其成熟蛋白的预测分子量为12.80kD,等电点为8.33。该基因编码的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫化学感受蛋白的氨基酸序列具有较高同源性。RT-PCR结果显示,GmolCSP在梨小食心虫成虫触角、去触角的头、胸、腹、足和翅中都有表达。将GmolCSP重组到表达载体pET-32a中,转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)进行表达。SDS-PAGE和Western印迹检测结果显示,梨小食心虫化学感受蛋白基因在大肠杆菌中成功地表达出一个分子量约为29kD的融合蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小一致。本研究结果为进一步研究该蛋白的分子结构和功能奠定了良好基础。 展开更多
关键词 梨小食心虫 化学感受蛋白 分子克隆 序列分析 原核表达 融合蛋白
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人S100A6-GST融合蛋白的原核表达和纯化 被引量:8
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作者 苗静琨 赖天霞 +5 位作者 左国伟 李星星 王嫣 蒋薇 何通川 周兰 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 2007年第10期1009-1012,共4页
目的:制备人S100A6-GST融合蛋白,为研究人S100A6((hS100A6)蛋白的功能奠定基础。方法:从pHAHA-hS100A6中双酶切获取hS100A6基因,亚克隆至原核表达载体pGST-moluc,构建pGST-moluc-hS100A6,转化BL21后,IPTG诱导重组菌表达hS100A6蛋白,SDS-... 目的:制备人S100A6-GST融合蛋白,为研究人S100A6((hS100A6)蛋白的功能奠定基础。方法:从pHAHA-hS100A6中双酶切获取hS100A6基因,亚克隆至原核表达载体pGST-moluc,构建pGST-moluc-hS100A6,转化BL21后,IPTG诱导重组菌表达hS100A6蛋白,SDS-PAGE及WesternBlot鉴定表达产物,Glutathion-Sepharose4B球珠分离纯化。结果:重组菌株表达出与理论预测值相符的一个约36ku的hS100A6融合蛋白,纯化后的融合蛋白的产量为3mg/L菌液,纯度约92%。结论:成功构建了hS100A6-GST原核表达质粒,在大肠杆菌中表达纯化后得到较高浓度的hS100A6-GST融合蛋白,为hS100A6蛋白功能的研究打下了基础。 展开更多
关键词 人S100A6基因 融合蛋白 原核表达 蛋白纯化
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结核分枝杆菌Ag85B与ESAT6融合蛋白的表达、纯化及抗原活性的初步研究 被引量:6
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作者 刘建利 师长宏 +3 位作者 靳亚平 张海 赵勇 赵雷 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期449-452,共4页
目的将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与ESAT6在大肠杆菌中融合表达,并对其进行纯化、鉴定和免疫学特性的初步研究。方法采用PCR方法从MTB毒株H37Rv基因组DNA中扩增Ag85B和ESAT6基因,并在两基因中引入48bp的柔性linker结构,以确保两蛋白的... 目的将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与ESAT6在大肠杆菌中融合表达,并对其进行纯化、鉴定和免疫学特性的初步研究。方法采用PCR方法从MTB毒株H37Rv基因组DNA中扩增Ag85B和ESAT6基因,并在两基因中引入48bp的柔性linker结构,以确保两蛋白的正确折叠。将各目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序。将测序正确的目的基因片段双酶切后亚克隆至原核表达载体pPro-EXHTa,得到重组质粒pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6,并转化入大肠杆菌DH5α。经IPTG诱导后进行融合表达,并分别用抗Ag85B和抗ESAT6的mAb进行Western blot分析鉴定。通过镍柱对融合蛋白进行纯化。在PBS中通过透析恢复重组蛋白的天然结构,将复性融合蛋白与8例临床可疑结核病人血清进行ELISA测定。结果PCR法扩增获得的各目的基因片段与GenBank报道的一致。构建的融合蛋白原核表达载体在大肠杆菌中表达后,经SDS-PAGE分析显示重组质粒在原核系统中得到了表达。融合蛋白能够分别与抗Ag85B和抗ESAT6的mAb反应。该融合蛋白主要以包涵体的形式存在,镍柱亲和层析纯化后得到了高纯度的Ag85B-ESAT6融合蛋白,并能够与结核病人血清发生反应。结论结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-ESAT6在大肠杆菌中得到了高效表达,为进一步研究其免疫原性和保护性提供了基础。 展开更多
关键词 AG85B ESAT6 柔性链 融合蛋白 原核表达 纯化
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