荧光短片段多重PCR在脊髓性肌萎缩症SMN1基因突变检测中的应用

目的设计特异性扩增引物,建立荧光短片段多重PCR技术检测SMN1基因拷贝数变异的方法,验证方法的检测性能并初步应用于基因拷贝数检测。方法选取107例来自神经系统疾病生物样本库的人外周血DNA样品(包括SMN1基因0拷贝30例、1拷贝47例、2拷贝30例),设计5’端带有FAM荧光基团的SMN1基因7号外显子引物以及三对内参基因引物,利用荧光短片段多重PCR技术,使用基因分析仪片段分析多重PCR的产物,并与相应的MLPA检测结果进行比较。结果特异性扩增SMN1基因7号外显子及内参基因的引物可实现目的片段的扩增,通过计算可得到0拷贝、1拷贝、2拷贝的样本结果。对107例DNA样本的SMN1基因拷贝数荧光短片段多重PCR的检测结果进行分析,实验结果均与MLPA检测结果相一致。结论使用荧光标记多重PCR反应检测SMN1拷贝数可重复性好,精确度高,与MLPA得到的结果高度一致,具有便捷、准确、成本低的优势,可满足临床高准确性的检测要求,可用于SMA新生儿携带者的大规模筛查。

SMN2基因甲基化与中国儿童型脊肌萎缩症疾病严重程度的相关分析（英文）

目的:分析我国脊肌萎缩症(SMA)患儿SMN2基因甲基化水平与其转录水平,并初步探讨该基因的甲基化修饰是否影响我国儿童型SMA疾病的严重程度。创新点:首次在中国儿童型SMA人群中分析SMN2基因甲基化状态,提示该基因的甲基化模式在不同人种间具有一定保守性,而甲基化单元的甲基化状态可能具有种族差异。本研究也初步提示SMN2基因甲基化水平除了可能影响该基因的转录,还可能影响基因的可变剪接。方法:应用MassA RRAY的方法检测35例SMA患儿(SMN1基因纯合缺失,SMN2基因3拷贝)外周血细胞中SMN2基因甲基化状态;应用实时聚合酶链反应(real-time PCR)的方法检测SMN2基因不同转录本的表达水平;分析SMN2基因甲基化与该基因的转录以及SMA疾病严重程度的关系。结论:位于甲基化岛1的两个甲基化单元(nt-871和nt-735)和位于甲基化岛4的nt+999甲基化单元的甲基化水平在III型患儿中显著低于II型和I型患儿;nt-871和nt-290/-288/-285甲基化单元的甲基化水平与SMN2基因全长转录本(SMN2-fl)的转录水平呈负相关。此外,nt+938甲基化单元的甲基化水平与SMN2基因全长转录本与跳跃外显子7转录本的比值(fl/?7)呈负相关,但与SMN2的转录水平无关。因此,我们初步得出SMN2基因甲基化可能通过调控其转录而影响我国儿童型SMA的疾病表型。

基于脊髓性肌萎缩症注册队列人群的基因诊断技术应用调查分析

目的调查分析基于中国罕见病注册系统中脊髓性肌萎缩症(SMA)队列人群相关基因诊断技术的应用现况和发展趋势。方法本项横断面调查研究以2016年7月至2018年12月在首都儿科研究所注册登记的200例SMA患儿为研究对象,通过查阅注册信息、基因检测报告以及电话随访等方式获得患儿基本信息、疾病分型、基因型、基因诊断相关信息等。按照检测时间分层后,分别统计采用不同基因诊断技术的人数和构成比,采用Pearson相关分析基因诊断技术的应用与时间的相关性。结果除3例资料不全的病例,共纳入197例SMA病例。SMAⅠ、Ⅱ和Ⅲ型的患儿分别为37例(18.8%)、115例(58.4%)和45例(22.8%),SMN1基因纯合缺失和复合杂合变异病例分别为185(93.9%)和12例(6.1%)。2004—2017年SMA基因诊断技术有7种:以多重连接探针扩增技术(MLPA)为主,占54.1%(100/185),其次是聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)和一代测序,分别为22.7%(42/185)和10.3%(19/185),等位基因特异性PCR(AS-PCR)、实时定量PCR(qPCR)、全外显子组测序(WES)及变性高效液相色谱分析(DHPLC)分别9、6、5和4例,占2.2%~4.9%。MLPA的应用从2010年开始逐步增加(r=0.95,P<0.05),而PCR-RFLP从2004年开始逐步下降(r=-0.99,P<0.05),其他检测方法应用与时间暂未发现相关性(P>0.05)。定量检测技术(MLPA、qPCR和DHPLC)的应用从2010年开始逐渐增高(r=0.94,P<0.05),定性检测技术(PCR-RFLP、一代测序、AS-PCR和WES)从2004年开始逐渐下降(r=-0.94,P<0.05)。纯合缺失与复合杂合变异的基因重复检测率分别为12.4%(23/185)和41.7%(5/12),差异有统计学意义(χ^(2)=5.86,P<0.05)。基因检测结果显示,同时提供SMN1、SMN2基因定量分析报告的构成比在2008—2015年为56.8%(21/37),2016—2017年上升至69.1%(56/81)。结论SMA基因检测技术从定性检测技术逐步发展为以MLPA和qPCR为主的定量检测技术。SMA定量检测报告不仅提供了SMN1致病基因的定量结果,也提供了SMN2修饰基因的定量结果。