转染VEGF-ASODN对胃癌细胞Survivin表达的影响

目的了解转染VEGF-ASODN(血管内皮生长因子反义寡核苷酸)对胃癌细胞Survivin(生存素)表达、细胞生长的作用.方法人工合成硫代磷酸化VEGF-ASODN,转染胃癌细胞SGC-7901,用Western-blot法检测细胞Survivin蛋白表达量、用流式细胞仪检测转染后细胞凋亡情况、用MTT检测转染后细胞生存力、细胞生长曲线检测转染后细胞生长情况.结果转染VEGF-ASODN能降低细胞Survivin蛋白,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),转染后细胞凋亡与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),能降低细胞的生存力及抑制细胞生长.结论VEGF-ASODN能抑制Survivin蛋白表达、抑制胃癌细胞生长、增加胃癌细胞的凋亡.

反义寡核苷酸抑制survivin基因表达及肝癌细胞生长的研究

目的:采用反义寡核苷酸抑制肝癌细胞中survivin基因的表达,研究其对肝癌细胞生长的作用。方法:采用脂质 体介导survivin反义寡核苷酸转染人肝癌细胞株SMMC-7721细胞,Western blot及原位杂交方法检测survivin蛋白及mRNA表 达,流式细胞仪检测凋亡细胞比率,检测转染前后细胞贴壁率变化,并绘制细胞生长曲线。结果:survivin反义寡核苷酸转染 后,肝癌细胞survivin蛋白及mRNA表达均显著降低,细胞贴壁率显著降低,细胞增殖活性明显受抑,细胞凋亡率显著增加。 结论:survivin反义寡核苷酸转染可以有效降低细胞内survivin基因的表达,诱导细胞发生凋亡,抑制肝癌细胞生长。

Survivin反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞株IL-6/STAT3信号通路的影响和意义

目的通过分析人卵巢癌细胞株转染Survivin反义寡核苷酸(ASODN)后IL-6/STAT3信号通路及其下游相关癌基因的表达以及其侵袭能力的改变,探讨Survivin ASODN在抑制人卵巢癌细胞转移中的可能作用、机制和临床价值。方法脂质体(LipofectamineTM2000)介导Survivin ASODN转染人卵巢癌SKOV3细胞株(实验组),同时设空脂质体对照,Transwell小室检测细胞株侵袭能力的改变,荧光定量PCR检测两组细胞株中白细胞介素6(IL-6)、信号转导与活化因子3(STAT3)、Survivin、血管内皮生长因子(VEGF)基因的表达,Western blot检测IL-6、STAT3、磷酸化的信号转导与活化因子3(p-STAT3)、Survivin、VEGF-A蛋白的表达。结果实验组细胞株中IL-6、STAT3、Survivin、VEGF基因表达均较对照组明显下调(P<0.05);实验组细胞株中IL-6、STAT 3、p-STAT 3、Survivin、VEGF-A蛋白表达均较对照组明显下调(P<0.05)。实验组细胞株侵袭能力较对照组明显下降(P<0.01)。结论 ASODN靶向抑制Survivin可有效降低人卵巢癌细胞侵袭转移能力,抑制IL-6/STAT3信号通路及其下游相关致癌基因的表达活性。Survivin ASODN可能在防治卵巢癌复发和转移治疗中有临床价值。

Survivin反义寡核苷酸增强U251人胶质瘤细胞对顺铂的敏感性研究

目的研究Survivin反义寡核苷酸对U251人胶质瘤细胞顺铂治疗敏感性的影响。方法脂质体介导Survivin反义寡核苷酸转染U251人胶质瘤细胞,Western blot法检测内源性Survivin表达水平的变化,MTT法检测顺铂对细胞生长情况的影响,流式细胞仪(FCM)观察顺铂诱导各组U251细胞的凋亡。结果反义Survivin脂质体复合物能有效下调Survivin表达水平,并且能抑制U251细胞的生长,提高U251细胞对顺铂的敏感性,流式细胞仪检测凋亡率明显提高。结论Survivin反义寡核苷酸能增强顺铂诱导的U251细胞凋亡,Survivin反义寡核苷酸和顺铂联合用药对U251细胞生存具有协同抑制效应,可改善治疗效果。

Survivin反义寡核苷酸诱导人胃癌细胞裸鼠皮下移植瘤细胞凋亡的研究

目的研究survivin反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)对人胃癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响,并探讨其诱导人胃癌移植瘤凋亡的分子生物学机制。方法建立SGC-7901胃癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型,随机分为4组,即survivin-ASODN+脂质体组、survivin-ASODN组、脂质体组和空白对照组(蒸馏水)。瘤体内隔日给药,停药后48小时处死裸鼠,剥离瘤组织,称取瘤重,计算抑瘤率。western-blot法检测各组凋亡相关蛋白survivin、Caspase-3蛋白的表达。结果 survivin-ASODN+脂质体组的移植瘤生长速度明显减慢,其抑瘤率为:33.19%。survivin-ASODN+脂质体组的survivin蛋白表达量明显低于对照组(P<0.05),Caspase-3蛋白表达高于对照组(P<0.05)。结论 survivin反义寡核苷酸转染胃癌移植瘤能够明显抑制肿瘤生长,其主要机制与降低survivin蛋白的表达,诱导Caspase-3高表达,从而促进肿瘤细胞凋亡有关。

双自杀基因联合Survivin反义寡核苷酸对结肠癌裸鼠的体内抑瘤作用

目的研究VEGF启动子驱动的双自杀基因(Ad-VEGFP-CDglyTK)联合Survivin反义寡核苷酸对裸小鼠体内结肠癌移植瘤的抑瘤作用。方法建立裸小鼠人结肠癌模型,将24只成瘤后的裸小鼠随机分为4组(n=6):空白对照组,不施加任何处理;重组腺病毒组,注射重组腺病毒Ad-VEGFP-CDglyTK与前药氟胞嘧啶(5-FC)、更昔洛韦(GCV);Survivin反义寡核苷酸(Survivin ASODN)组,注射Survivin ASODN;基因联合治疗组,注射重组腺病毒Ad-VEGFP-CDglyTK与前药5-FC、GCV,同时注射Survivin ASODN。治疗后测定瘤重并计算肿瘤生长抑制率;将瘤组织进行HE染色;免疫组化检测微血管密度(MVD)。结果各组最终瘤重及肿瘤生长抑制率分别为:空白对照组516.58±10.58mg,0%;重组腺病毒组238.74±15.77mg,53.78%±3.12%;Survivin ASODN组225.61±13.47mg,56.23%±2.60%;基因联合治疗组63.70±3.41mg,87.66%±0.70%。空白对照组与其他3组有显著差异(P<0.05),基因联合治疗组与重组腺病毒组、Survivin ASODN组比较亦有显著性差异(P<0.05)。常规病理检查可见肿瘤细胞生长受抑制,特别是基因联合治疗组抑瘤作用最明显,肿瘤组织切片中可见片状坏死区,而且这些区域可见大量炎性细胞浸润。空白对照组、重组腺病毒组、Survivin ASODN组和基因联合治疗组MVD分别为19.25±3.19、11.33±2.46、10.42±2.35、3.33±1.56,空白对照组MVD明显高于其他3组(P<0.05),重组腺病毒组及Survivin ASODN组MVD均显著高于基因联合治疗组(P<0.05)。结论VEGF启动子驱动的双自杀基因和Survivin ASODN均具有一定的体内抑瘤作用,两者联合应用具有协同作用,对于肿瘤的抑制作用更加显著。

VEGF与Survivin反义寡核苷酸对裸鼠荷舌癌肿瘤的作用

目的︰研究血管内皮细胞生长因子反义寡核苷酸(VECF-ASODN)和生存素(Survivinm)反义寡核苷酸(Survivin-ASODN)联合转染对裸鼠体内Tca8113舌癌细胞的作用。方法﹐25只雌性裸鼠分为5组,每组5只,建立移植瘤模型,并注入相应的试剂。①联合ASODN组:每次在裸鼠瘤体及瘤周注入Survivin-ASODN,VECF-ASODN各66μg,注射液体积为200μl,内含LipofectamineTM 2000和无血清1640液。②VECF-ASODN组;同上述方法注射VECF-ASODN 66μg。③Survivin-ASODN组:同法注射Survivin-ASODN 66μg。④脂质体组:同法注射等量脂质体200μl。⑤生理盐水(NS)组:注射等量NS200μl。3天注射1次,共7次。实验结束2天后,全麻下处死裸鼠,称取肿瘤重量并测量大小,肿瘤制作石蜡切片,免疫组织化学方法测VECF,Survivin,PCNA,CD34表达水平,计算肿瘤微血管密度(microvessel density,MVD)和肿瘤增殖细胞核抗原标记指数(PCNA Iabel index,PLI)。结果﹑联合ASODN组裸鼠移植瘤的重量、体积、VECF和Survivin蛋白,PCNA、CD34表达水平明显降低。结论VEGF-ASODN和Survivin-ASODN联合转染Tca8113舌癌细胞,明显抑制VECF和Survivin表达水平,并且抑制癌细胞生长和增殖。

存活素反义寡核苷酸在人甲状腺髓样癌裸鼠模型中的抑瘤作用

目的探讨存活素(survivin)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxyribonucleotide,ASODN)在人甲状腺髓样癌裸鼠模型中的抑瘤作用。方法构建12只人甲状腺髓样癌裸鼠模型,随机分配到正常组,SODN(sense oligodeoxyribonucleotide,正义寡核苷酸)组和ASODN组,每组4只。各组每日一次瘤内注射相应处理液,连续7d。治疗结束后1周,杀死全部瘤鼠,切取瘤体,测算瘤重和抑瘤率以评价肿瘤生长情况,瘤组织石腊切片分别行HE、免疫组化(IHC)和DNA末端原位标记法(TUNEL法)染色以评价组织病理构造、survivin与VEGF蛋白表达和细胞凋亡的变化。结果HE染色显示ASODN组具有明显减低的血管新生特点。此外,相对于正常组和SODN组,ASODN组具有显著的survivin和VEGF低表达、高凋亡、低瘤重和高抑瘤率特点(各P<0.01),而正常组与SODN组间未见上述各特点的统计学差异。结论本研究证实针对人甲状腺髓样癌survivin基因沉默治疗能够达到明显抑瘤效果,此效果至少部分通过促进肿瘤调亡和抑制肿瘤血管新生而实现。这提示survivin基因在人甲状腺髓样癌中具有重要意义和其可成为人甲状腺髓样癌基因靶向沉默治疗的重要候选基因之一。

靶向抑制存活素表达对卵巢癌细胞株生物学行为的影响和意义

目的通过存活素(Survivin)反义寡核苷酸(ASODN)转染人卵巢癌SKOV3细胞株抑制存活素Survivin蛋白表达,分析靶向抑制Survivin表达对卵巢癌细胞生长、细胞周期改变、凋亡、侵袭迁移能力的影响和意义。方法用脂质体(Lipofectamine^(TM)2000)介导Survivin ASODN转染人卵巢癌细胞株SKOV3,通过四唑盐比色法(MTT法)分析细胞生长活性改变,通过流式细胞仪检测Survivin蛋白表达改变、细胞周期分布和细胞凋亡率,通过Transwell小室检测细胞侵袭迁移能力的改变。结果转染Survivin ASODN后卵巢癌细胞株中Survivin蛋白表达明显下降(t=7.82,P<0.01)。细胞生长明显减慢(F=3.75,P<0.01),600nm/L ASODN转染48小时细胞存活率为49.50±20.76%,接近IC_(50)值。细胞凋亡明显增加(t=6.37,P<0.05),细胞增殖明显下降(t=-10.35,P<0.01),更多的细胞停留在G0/G1期(t=10.38,P<0.01)。细胞迁移和侵袭能力下降(t值分别为19.26、27.42,均P<0.01)。结论 Survivin ASODN通过靶向抑制卵巢癌细胞存活素表达,可抑制细胞生长,促进细胞凋亡,减少进入有丝分裂的细胞数,降低细胞的侵袭迁移能力,从而达到治疗卵巢癌的作用。靶向抑制存活素的治疗将成为卵巢癌治疗的重要手段。

生存素反义寡核苷酸对胃癌细胞株SGC-7901生长的影响

目的 观察生存素蛋白在胃癌细胞株SGC 790 1中的表达及转染不同浓度的生存素反义寡核苷酸(ASODN )对胃癌细胞SGC- 790 1生长的影响。方法 采用细胞免疫组织化学染色观察生存素蛋白在胃癌细胞株SGC- 790 1中的表达。将胃癌细胞株SGC 790 1分为8个组:空白对照组,脂质体转染组,2 0 0nmol/L、40 0nmol/L、60 0nmol/L无义链转染组,2 0 0nmol/L、40 0nmol/L、60 0nmol/L反义链转染组,转染48h后,采用四氮唑盐(MTT )比色法,测定各组的细胞生长抑制率,并采用流式细胞仪检测60 0nmol/L无义链转染组、60 0nmol/L反义链转染组细胞的凋亡率以及生存素蛋白表达。结果 显示生存素蛋白在胃癌细胞株SGC- 790 1的胞核和胞质中均有表达,但以胞核为主;各组生存素ASODN对胃癌细胞株SGC- 790 1有明显的抑制作用(P <0 .0 1) ,抑制作用呈浓度依赖性,60 0nmol/L反义链转染组抑制率为最高,达40 .0 % ,流式细胞仪检测表明生存素ASODN有明显的诱导细胞凋亡的作用,定量检测结果显示生存素ASODN可以下调生存素蛋白至8.8% (P <0 .0 1)。结论 不同浓度的生存素ASODN均能通过下调生存素蛋白表达来抑制胃癌细胞株SGC- 790 1的生长。

反义寡核苷酸转染A375细胞实验条件的优化

目的研究不同的转染条件下,Survivin反义寡核苷酸(ASODN)对体外培养的人恶性黑色素瘤细胞A375生长的影响。方法通过对ASODN进行硫代修饰、脂质体运转及培养条件的改变,用倒置显微镜、台盼蓝计数观察Survivin ASODN对A375细胞增殖的抑制作用。结果硫代修饰ASODN经脂质体包裹对细胞生长抑制作用明显强于未经脂质体包裹组(P<0.01);②细胞培养6 h贴壁后进行转染对细胞的生长抑制率明显高于24 h后进行转染(P<0.05);③转染期间(4 h)无血清存在组与相应对照组比较差异有显著性意义(P<0.01);④ASODN转染后12-72 h,对细胞的抑制效应逐渐升高,72 h达顶峰,之后开始回落;⑤与混杂组(SODN)及错配组(MODN)相比,反义组在各个浓度对细胞生长抑制作用最明显,各浓度组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论许多因素影响ASODN的转运,不同的实验应选择不同的实验优化条件。

存活素蛋白表达下调对卵巢癌细胞侵袭能力影响的实验研究

目的通过存活素(Survivin)反义寡核苷酸(ASODN)转染下调人卵巢癌细胞株SKOV3中Survivin蛋白表达,观察细胞侵袭能力的改变,探讨Survivin蛋白表达可能在调节卵巢癌细胞侵袭能力中的作用。方法用脂质体(LipofectamineTM2000)介导ASODN转染人卵巢癌细胞株SKOV3,流式细胞学技术检测细胞转染率及其Survivin蛋白表达,Transwell小室检测细胞侵袭能力的改变。结果LipofectamineTM2000介导ASODN人卵巢癌细胞株SKOV3转染,FCM检测转染率>95%。用600 nm/L ASODN转染48 h后,细胞中Survivin蛋白表达明显下调(t=7.8146,P<0.01),侵袭细胞数也明显下降(t=27.416,P<0.01)。结论卵巢癌细胞中Survivin蛋白表达下调,可降低卵巢癌细胞侵袭能力,提示Survivin蛋白可能是影响卵巢癌侵袭能力的重要分子,在卵巢癌转移机制中起关键性作用。

VEGF-ASODN转染对胃癌细胞VEGF和survivin表达的影响

目的观察血管内皮细胞生长因子反义寡核苷酸(VEGF-ASODN)转染胃癌细胞SGC-7901对血管内皮生长因子(VEGF)和生存素(survivin)表达的影响。方法人工合成硫代磷酸化VEGF-ASODN。实验分为5组:对照组,错义组,实验1组(转染浓度为100ng/mL),实验2组(转染浓度为400ng/mL)及实验3组(转染浓度为700ng/mL)。转染后实时荧光定量RT-PCR检测细胞RNA起始拷贝数;ELESA法检测细胞及培养上清液VEGF蛋白含量;Western-blot法检测细胞生存素蛋白表达量;流式细胞仪检测细胞凋亡;细胞生长曲线检测转染对细胞生长的影响。结果3个实验组VEGF mRNA水平和VEGF蛋白表达量及培养上清液VEGF蛋白含量均明显降低,survivin蛋白的表达水平随转染浓度的升高而降低,转染VEGF-ASODN能使胃癌细胞凋亡增加、细胞生长减缓。结论VEGF-ASODN转染胃癌细胞SGC-7901能显著抑制细胞VEGF的表达,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖。

survivin反义寡核苷酸提高人肺腺癌A549耐药细胞系对顺铂敏感性的研究

目的探讨存活素反义寡核苷酸(ASODN)体外转染对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/ CDDP凋亡及其对顺铂(CDDP)敏感性的影响。方法常规体外培养A549/CDDP细胞,以脂质体包裹的survivin ASODN转染细胞,采用RT-PCR法和免疫细胞化学法检测survivin mRNA及蛋白表达。通过形态学观察、DNA琼脂糖凝胶电泳、caspase-3酶活性及细胞凋亡率(AI)的测定,评价细胞凋亡程度。采用MTT法测定细胞存活率和生长抑制率,计算半效抑制浓度(IC_(50))及耐药倍数(RI)。结果转染组survivin mRNA及蛋白表达下调明显,分别达41．56%和0．864±0．045,与其他各组比较,差异均有统计学意义(P＜0．05)。细胞形态学显示有细胞凋亡改变,表现为细胞核固缩、核边集和核碎裂等；DNA凝胶电泳可见DNA梯形条带；ASODN转染组细胞凋亡率和caspase-3相对活性分别增高至34．03%和1．1298±0．2502,而ASODN+CDDP组增高更为明显,分别达65．85%和1．6805±0．2758,与其他各组比较,差异均有统计学意义(P＜0．05)。ASODN转染组和ASODN+CDDP组生长抑制率分别增高至59．3%和83．7%(P＜0．05)；而ASODN转染组细胞对CDDP的IC_(50)由对照组的(225．03±10．59)μmol/L减低至(158．84±4．26)μmol/L,RI由11．9减至8．4。结论survivin ASODN通过下调survivin的表达,自身诱导了细胞凋亡,并逆转细胞对CDDP诱导的细胞凋亡的耐受,降低凋亡阈值,从而增强了人肺腺癌细胞对CDDP的敏感性。

靶向抑制Survivin途径对人卵巢癌细胞侵袭能力及其腹腔移植瘤生长的影响

目的通过分析靶向抑制Survivin基因表达后人卵巢癌SKOV3细胞系侵袭能力及其裸鼠腹腔移植瘤生长的变化,探讨靶向Survivin途径可能在抑制人卵巢癌SKOV3细胞系转移能力和腹腔移植瘤形成中的作用及可能的临床价值。方法用脂质体(Lipofectamine TM 2000)介导Survivin反义寡核苷酸(Survivin ASODN)转染人卵巢癌SKOV3细胞系,作为实验组(ASODN组),同时设空白脂质体作为对照组,通过Transwell小室检测两组细胞侵袭能力的改变。构建人卵巢癌SKOV3细胞系裸鼠腹腔转移瘤模型,通过Survivin ASODN腹腔注射干预,作为实验组(ASODN组),同时设生理盐水作为对照组,比较两组动物模型腹腔转移瘤生长情况的改变,并通过实时荧光定量PCR技术和蛋白印迹法检测人卵巢癌SKOV3细胞系和腹腔转移瘤组织中Survivin mRNA及蛋白表达的改变。结果转染Survivin ASODN后,人卵巢癌SKOV3细胞系侵袭能力均较对照组明显下降,差异有统计学意义(t=12.44,P<0.01)。经Survivin ASODN腹腔注射干预后,裸鼠腹腔移植瘤数量和重量都较对照组明显减小,差异均有统计学意义(t=12.36,P<0.01;t=3.00,P<0.01)。ASOND组人卵巢癌SKOV3细胞系及腹腔转移瘤组织中Survivin mRNA表达均较对照组明显下调,差异均有统计学意义(t=12.47,P<0.01;t=3.06,P<0.05);ASOND组人卵巢癌SKOV3细胞系及腹腔转移瘤组织中Survivin蛋白表达均较对照组明显下调,差异均有统计学意义(t=8.71,P<0.01;t=2.32,P<0.05)。结论靶向抑制Survivin途径不仅在活体外还在活体内均能有效降低卵巢癌细胞侵袭和转移能力,能有效抑制卵巢癌细胞腹腔转移瘤的形成和生长。腹腔注射Survivin ASODN可能成为临床防治卵巢癌复发和转移的重要生物治疗手段。

聚酰胺树形分子递送Survivin反义寡核苷酸诱导结肠癌细胞凋亡的研究

目的观察聚酰胺（PAMAM）树形分子高聚合物介导Survivin反义寡核苷酸（Sur—vivin—asODN）转染结直肠癌SW620细胞的可行性以及对结直肠癌SW620细胞凋亡的影响。方法制备PAMAM反义基因复合物和阳离子脂质体反义基因复合物，透射电镜观察复合物的形态，激光散射粒径分析仪测定粒径，zeta电位分析仪测定zeta电位，离心法和紫外分光分度仪测定复合物的的包封率、载药率和体外DNA释放速度。将上述两种基因转染复合物转染结直肠癌细胞，测定其转染效率；检测转染后细胞中Survivin蛋白的表达和细胞的凋亡率。结果PAMAM—Survivin—asODN复合物的粒径小于脂质体-Survivin—asODN复合物的粒径（P〈0．01），但zeta电位高于后者（P〈0．05）；基因载药率、包封率两组差异无统计学意义；PAMAM对DNA持续释放14d，但脂质体只持续5d。PAMAM-Survivin—as ODN转染结直肠癌细胞的效果强于脂质体-SurvivinasODN（P〈0．05）。转染后结直肠癌细胞Survivin蛋白的表达低于脂质体复合物（P〈0．05），细胞的凋亡率高于脂质体复合物（P〈0．05）。结论PAMAM能将Survivin—as ODN高效递送到结直肠癌SW620细胞，降低Survivin蛋白表达并诱导结直肠癌细胞凋亡。

生存素反义寡核苷酸对血管瘤血管内皮细胞增殖及Caspase-3活性影响研究

目的观察生存素(Survivin)反义寡核苷酸(ASODN)对人血管瘤血管内皮细胞凋亡的影响,并初步探讨其作用机制。方法实验于2007年12月至2010年2月完成。以靶向Survivin基因中与Caspase-3结合的部位为模板,设计合成ASODN并通过脂质体将其转染至人血管瘤血管内皮细胞中。MTT观察Survivin ASODN对血管瘤血管内皮细胞增殖的影响;分光光度法检测Caspase-3酶活性。结果 Survivin ASODN可以显著抑制血管瘤血管内皮细胞增殖,而且抑制程度与Survivin ASODN浓度成正比。Survivin ASODN作用于血管瘤血管内皮细胞,Caspase-3酶活性呈时间、剂量依赖性升高。结论以靶向Survivin基因中与Caspase-3结合的部位为模板设计合成的ASODN可显著抑制人血管瘤血管内皮细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制与提高Caspase-3酶活性有关。