消岩汤含药血清介导下Survivin siRNA对人肺腺癌A549细胞增殖及凋亡的影响

[目的]分析消岩汤含药血清介导下Survivin siRNA对人肺腺癌A549细胞增殖及凋亡的影响,探究其抑瘤机制。[方法]在Invitrogen公司的网上设计系统中设计靶向Survivin基因的siRNA序列,并将其转染A549细胞,应用噻唑蓝(MTT)法检测消岩汤以及转染组对A549细胞生长抑制的情况,免疫组化法观察A549细胞Survivin蛋白的表达情况,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。[结果]MTT法显示消岩汤具有抑制A549细胞生长的作用,其作用具有一定的时间依赖性,转染中药组的抑制率显著高于转染对照组及非转染中药组。经免疫组化法检测,转染对照组对Survivin蛋白表达的抑制率明显高于非转染中药组,但显著低于转染中药组。流式细胞术检测结果显示消岩汤及重组质粒以诱导细胞晚期凋亡为主,转染中药组A549细胞凋亡率显著高于其他各组。[结论]消岩汤可诱导A549细胞的凋亡,联合应用转染靶向Survivin基因的重组质粒可增强其体外诱导A549细胞凋亡的作用。

Survivin siRNA对甲状腺乳头状癌细胞裸鼠移植瘤血管生成的影响

目的探讨凋亡抑制基因Survivin的小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA)对甲状腺乳头状癌细胞株K1裸鼠移植瘤血管生成的影响。方法将表达特异性Survivin si RNA序列的质粒载体,与表达无关序列si RNA的质粒载体分别转染K1细胞;G418筛选出稳定表达Survivin si RNA和表达无关序列si RNA的K1细胞,与未转染的K1细胞分别注射于裸鼠皮下,观察三组移植瘤的生长速度。SP免疫组化法检测各组移植瘤中的微血管密度(MVD)。结果 Survivin si RNA组比无关序列si RNA组肿瘤平均质量减少56%,比未转染组肿瘤平均质量减少63%;Survivin si RNA组MVD明显低于无关序列si RNA组及未转染组(P<0.05);无关序列si RNA组与未转染组MVD值差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Survivin si RNA可抑制甲状腺乳头状癌细胞K1裸鼠移植瘤的微血管生成及肿瘤生长。

Survivin siRNA联合紫杉醇对肺癌细胞株的生长抑制作用

目的探讨survivin siRNA对肺癌A549细胞化疗敏感性的影响。方法将A549细胞分为siRNA转染组、N-siRNA转染组、阴性对照组、空白对照组,用MTT法检测不同浓度紫杉醇联合siRNA对细胞存活率的影响。将A549细胞分为阴性对照组、siRNA组、紫杉醇组、siRNA+紫杉醇组,采用MTT法检测siRNA联合紫杉醇作用不同时间对细胞存活率的影响;采用Western blot检测细胞内survivin、p21、PARP蛋白表达变化;采用流式细胞仪分析各组细胞周期和凋亡变化的差异。结果Survivin siRNA可增加A549细胞对不同浓度紫杉醇的敏感性,但以低浓度(0.1、1、10nmol/L)最显著(P<0.05);survivin siRNA与10nmol/L紫杉醇共同处理A549细胞48h后,对细胞增殖的抑制具有协同或相加的效果(q值分别为1.34、1.03、1.02)。siRNA不仅可以抑制A549细胞内源性survivin表达还可以抑制紫杉醇诱导的survivin表达,阴性对照组、紫杉醇组、siRNA组和siRNA+紫杉醇组中survivin蛋白条带相对强度分别为0.244、0.99、0、0;survivin siRNA和紫杉醇联合作用后,对凋亡的诱导也有轻度相加作用,阴性对照组、紫杉醇组、siR-NA组和siRNA+紫杉醇组凋亡率分别为0.47%、9.50%、4.78%、19.81%;与对照组相比,siRNA和紫杉醇联合作用对细胞周期的影响表现为G1期、G2/M期细胞增加,S期细胞比率明显减少,对PARP的裂解和p21蛋白的表达也有促进作用。结论Survivin过表达可能参与了紫杉醇获得性耐药的形成,siRNA阻抑survivin表达是增加肺癌细胞对紫杉醇敏感性的有效途径。

厄洛替尼联合Survivin siRNA对人肺腺癌细胞A549增殖的影响

目的探讨厄洛替尼联合Survivin siRNA对人肺腺癌细胞A549增殖的影响。方法选用Survivin siRNA转染和厄洛替尼单独或联合应用于人肺腺癌细胞A549,作用48 h后,应用四甲基偶氮唑蓝比色法检测其对细胞增殖的抑制作用,免疫组化法观察Survivin蛋白表达的变化。结果 Survivin siRNA转染和厄洛替尼两者单独或联合应用于人肺腺癌细胞A549作用48 h后,两种因素单独或联合应用都对细胞增殖有明显的抑制作用,其抑制率分别为(47.68±4.09)%、(60.28±3.23)%、(78.14±4.34)%,较对照组差别有统计学意义(P<0.01),并能明显降低细胞内Survivin蛋白的表达水平,联合应用较两者单独应用对细胞增殖的抑制作用更显著(P<0.01),对Survivin蛋白表达的抑制作用更强。结论应用siRNA沉默Survivin表达可以提高肺腺癌细胞对厄洛替尼的敏感性。

Survivin siRNA对人肺腺癌细胞SPCA1和SH77抑制作用的比较分析

背景与目的 Survivin是IAP家族的新成员,具有抑制凋亡和调节细胞增殖的双重作用,是迄今发现最强的凋亡抑制因子。本项研究的目的是通过将survivin的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体分别转染至肺癌细胞SPCA1和SH77,分析survivin siRNA对不同肺癌细胞的增殖抑制作用。方法构建靶向survivin的siRNA表达载体与pSi scrambled,经由脂质体法分别转染至肺癌细胞SPCA1和SH77。通过MTT法检测细胞增殖抑制,用流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期,利用半定量RT-PCR和Western blot印迹法分别检测细胞survivin mRNA及蛋白表达水平。结果 Survivin siRNA干预后,SPCA1和SH77细胞均出现凋亡,G0/G1期阻滞。实验组Survivin mRNA水平和蛋白表达水平比脂质体对照组明显减少。结论 Survivin基因特异性RNA干扰可以明显抑制肺癌SPCA1和SH77细胞的体外增殖并诱导明显的细胞凋亡。

凋亡抑制基因Survivin siRNA真核表达载体的构建

目的构建靶向survivin siRNA真核表达载体,通过RNA干扰技术阻断survivin基因表达。方法针对目的基因survivin序列设计双链DNA(dsDNA),采用DNA重组技术与载体连接,转化感受态细胞经诱导表达筛选阳性克隆子。结果重组质粒经酶切、测序鉴定,证实插入载体目的基因片段大小与插入方向正确,符合其物理图谱。结论靶向survivin siRNA真核表达载体可用于转染肿瘤细胞,阻断survivin基因表达并诱导细胞凋亡的RNAi实验研究,为肿瘤的基因治疗提供一种新的方法。

3种不同的survivin siRNA对EJ28细胞增殖和凋亡的影响

目的观察靶向survivin的不同siRNA对EJ28细胞增殖和凋亡的影响。方法通过化学合成方法合成3对siRNA和1对荧光标记的阴性对照siRNA。转染荧光标记的siRNA后,在荧光显微镜下观察转染效率。实验分为siRNA164、siRNA167、siRNA389、阴性对照组、脂质体对照组和细胞对照组。转染后24、48h和72h,MTT法检测siRNA对EJ28细胞增殖的影响,流式细胞术检测凋亡率。结果靶向survivin的序列特异性siRNA均能抑制EJ28细胞的增殖,其中以siRNA164抑制细胞的增殖能力最强(P<0.05),转染48h后的抑制率最高[(41.32±2.54)%];转染48h后,siRNA164组凋亡率最高[(13.20±0.25)%]。结论靶向survivin的RNAi技术在膀胱癌的基因治疗中可能具有一定的价值。

以量子点为载体转染Survivin siRNA至人舌鳞癌Tca8113细胞中的实时观察

目的通过量子点(quantum dot,QD)为载体将靶向Survivin基因的siRNA转染至人舌鳞癌Tca8113细胞中,并通过激光共聚焦显微镜实时观察转染过程,以期在肿瘤治疗的同时对其进行实时影像学观察。方法表面带正电荷的水溶性量子点,通过正负电荷的吸引力与表面带负电荷的Survivin siRNA以1∶2比例结合成QDsiRNA复合物。QD-siRNA复合物通过内吞作用进入人舌鳞癌Tca8113细胞,用激光共聚焦显微镜对QD-siRNA复合物转染至细胞中的过程和分布情况进行实时动态观察。结果激光共聚焦显微镜观察显示QD成功将Survivin siRNA转染至人舌鳞癌Tca8113细胞中,QD-siRNA复合物加入培养皿15 min后开始吸附至细胞膜上,并慢慢穿透胞膜到达胞浆,直至6 h可见QD-siRNA复合物充分进入细胞,QD主要分布在细胞质中,而siRNA在细胞质和细胞核中均有分布。来自QD的红色荧光强度大于来自siRNAFAM的绿色荧光。结论激光共聚焦显微镜观察QD成功将Survivin siRNA转染至人舌鳞癌Tca8113细胞中,QD相对于羧基荧光素更适于进行细胞动态观察。

Survivin siRNA、HSP70双基因转染对乳腺癌细胞株MCF7 survivin及HSP70表达的影响

目的探讨survivin siRNA、HSP70双基因转染对乳腺癌细胞株MCF7survivin、HSP70表达的影响。方法常规培养乳腺癌细胞株MCF7,将已构建的真核表达载体(pIRES2-EGFP-survivin siRNA、pIRES2-EGFP-HSP70)用脂质体介导转染MCF7细胞,利用倒置荧光显微镜观察转染后的细胞,通过western-blot、RT-PCR检测转染后细胞中HSP70蛋白、survivin蛋白及survivinmRNA表达的变化。结果转染空载体与转染真核表达载体的乳腺癌细胞株MCF7于倒置荧光显微镜下可见绿色荧光,证实转染成功。转染真核表达载体的MCF7细胞与转染空载体的MCF7细胞和未转染的MCF7细胞相比,survivin mRNA和survivin蛋白表达水平降低,而HSP70蛋白表达升高。结论 survivin siRNA能有效抑制MCF7细胞内源survivin基因的表达,HSP70能上调MCF7细胞HSP70蛋白的表达,为进一步深入研究survivin siRNA、HSP70双基因对乳腺癌细胞株MCF7生物学特性的影响奠定实验基础。

Survivin siRNA对肝癌种植瘤survivin基因表达及生长的影响

目的观察Survivin siRNA对裸鼠肝癌种植瘤Survivin基因表达以及肿瘤生长的影响。方法利用肝癌细胞株构建动物模型,将脂质体包裹的Survivin siRNA经静脉注入裸鼠种植瘤体内,以无关siRNA为对照组,观察动物及瘤体的变化,RT-PCR法检测瘤组织survivin mRNA水平,Western blot法检测瘤组织survivin蛋白表达情况。结果Survivin siRNA注射组(SU-IV组)在注射后10 d肿瘤体积较对照组明显缩小,差异有显著性(P<0.05)。SU-IV组survivin mRNA及蛋白表达水平均低于对照组(P<0.001)。结论 Survivin siRNA能抑制裸鼠肝癌种植瘤的生长,注射后瘤组织Survivin mRNA及蛋白表达下调。

Survivin siRNA纳米脂质体体内抗结肠癌活性研究

目的观察Survivin siRNA纳米脂质体对裸鼠结肠癌种植瘤Survivin基因表达以及肿瘤生长的影响。方法利用结肠癌细胞LOVO细胞株构建动物模型,将脂质体包裹的Survivin siRNA经静脉注入裸鼠种植瘤体内,以无关siRNA为对照组,观察动物及瘤体的变化,RT-PCR法检测瘤组织Survivin mRNA水平,Western blot法检测瘤组织survivin蛋白表达情况。结果 Survivin siRNA注射组(SU-IV组)在注射10剂后肿瘤体积较对照组明显缩小,差异有显著性(P<0.05)。SU-IV组Survivin mRNA及蛋白表达水平低于对照组(P<0.001)。结论 Survivin siRNA纳米脂质体能抑制裸鼠结肠癌种植瘤的生长,注射Survivin siRNA纳米脂质体后肿瘤组织Survivin mRNA及蛋白表达下调。

凋亡抑制因子Survivin siRNA荧光表达载体的构建

目的构建靶向survivin siRNA真核表达质粒载体,通过RNA干扰技术阻断survivin基因的表达。方法针对目的基因survivin序列设计双链DNA(dsDNA),采用DNA重组技术与载体连接,转化感受态细胞经诱导表达筛选阳性克隆子。结果重组质粒经酶切、测序鉴定,证实插入载体目的基因片段大小与插入方向正确,且转染至肿瘤细胞,可见其发出绿色荧光,转染率为70%-80%。结论靶向survivin-siRNA真核表达载体pGU6/GFP/Neo/survivin-siRNA可用于转染肿瘤细胞、阻断survivin基因表达并诱导细胞凋亡的RNA i实验研究,为肿瘤的基因治疗奠定一定的基础。

Survivin siRNA纳米载体的制备及其对胰腺癌细胞生物学特性的影响

目的:利用纳米技术和基因干扰技术设计并合成携载survivin siRNA的纳米载体,探讨survivins iRNA纳米微粒对人胰腺癌细胞BXPC-3增殖和凋亡的影响。方法:体外培养人胰腺癌BXPC-3细胞,将BXPC-3细胞随机分为4组:生理盐水组、不含基因的纳米微粒组、survivin siRNA组和s urvivins iRNA纳米微粒组。RT-PCR检测survivin mRNA的表达;Wes tern blot法检测s urvivin蛋白的表达;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;MTT法检测细胞增殖情况。结果:细胞培养72 h后,survivin siRNA纳米微粒组细胞的survivin mRNA和蛋白表达均低于其他3组(P<0.05)。survivin siRNA纳米微粒组细胞增殖明显受抑制,生长缓慢,而细胞凋亡率高于其他3组(P<0.05)。结论:survivin siRNA纳米微粒能够有效减少胰腺癌BXPC-3细胞survivin mRNA和蛋白的表达,提高肿瘤细胞的凋亡,显著抑制BX-PC-3细胞的增殖。

靶向Survivin siRNA对乳腺癌MCF-7细胞雌激素受体表达的影响

目的探讨靶向Survivin siRNA对乳腺癌MCF-7细胞雌激素受体表达的影响。方法构建靶向Survivin siRNA载体,按照质粒类型分为空白对照组、阴性对照组和阳性实验组,空白对照组仅加入Lipofectamine 2000,阴性对照组加入空载质粒,阳性实验组加入靶向Survivin siRNA质粒,采用RT-PCR检测Survivin、ER mRNA表达水平,采用Western blot检测细胞Survivin、ER蛋白表达水平,并采用MTT法检测各组对MCF-7细胞增殖抑制率。结果以β-actin作为内参照,空白对照组Survivin、ER mRNA表达量分别为(1.17±0.14)和(0.79±0.11),阴性对照组分别为(1.15±0.12)和(0.80±0.09),阳性实验组分别为(0.43±0.03)和(1.94±0.41),阳性实验组Survivin mRNA表达显著低于空白对照组、阴性对照组,ER mRNA表达显著高于空白对照组、阴性对照组(均P<0.05);空白对照组、阴性对照组Survivin、ER mRNA表达量比较差异无统计学意义(均P>0.05)。Western blot结果显示,阳性实验组Survivin蛋白表达显著低于空白对照组和阴性对照组,ER蛋白表达显著高于空白对照组和阴性对照组。细胞增殖实验结果显示,阳性实验组接种12、24、48h后MCF-7细胞增殖的抑制率逐渐升高,并显著高于同时段空白对照组和阴性对照组(均P<0.05)。结论通过siRNA技术干扰Survivin表达能够显著提高MCF-7细胞雌激素受体表达水平,靶向Survivin siRNA在ER阳性乳腺癌的基因治疗中具有潜在的临床价值。

Survivin siRNA对卵巢癌细胞侵袭的影响

目的:探讨survivin靶向小分子干扰RNA(siRNA)对卵巢癌细胞侵袭的影响。方法:在survivin基因的编码区内根据干涉位点的设计原则,体外转录合成survivin siRNA,转染人卵巢上皮性癌细胞株SKOV3细胞,用Westernblot方法鉴定干涉位点对survivin基因蛋白的干扰效果;细胞侵袭实验(transwell)检测细胞体外侵袭能力的变化。结果:survivin siRNA能有效抑制survivin蛋白的表达,siRNA组survivin蛋白的相对表达水平分别与空白对照组、非特异性组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。特异性干涉组细胞的侵袭能力明显低于非特异性干涉组及空白对照组,差异均具有统计学意义(P<0.001)。结论:特异性的survivin siRNA能有效降低卵巢癌细胞survivin的表达,抑制细胞侵袭能力,这为卵巢癌的基因治疗提供了一种新策略。

厄洛替尼联合survivin siRNA对人肺腺癌细胞A549增殖的影响

目的:探讨厄洛替尼联合survivin siRNA对人肺腺癌细胞A549的作用。方法:survivin siRNA转染、厄洛替尼单独或联合应用于人肺腺癌细胞A549,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察对A549细胞的增殖抑制作用,免疫组化染色法观察A549细胞Survivin蛋白的表达情况。结果:survivin siRNA转染联合厄洛替尼对A549细胞具有明显的抑制作用,且可明显降低A549细胞Survivin蛋白的表达,与单独应用survivin siRNA转染和厄洛替尼比较均有统计学意义(P<0.01)。结论:应用siRNA沉默survivin表达可提高人肺腺癌细胞A549对厄洛替尼的敏感性。

Survivin siRNA对人脐静脉内皮细胞的Survivin基因及蛋白表达与凋亡的作用

目的探讨Survivin siRNA对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的Survivin基因与蛋白表达及凋亡的影响。方法合成Survivin siRNA转染混合物,以不同浓度转染HUVEC细胞,MTT法测定细胞生长抑制率,RT-PCR、Western blot检测HUVEC细胞Survivin mRNA及蛋白的表达变化,流式细胞术检测细胞的凋亡率。结果HUVEC细胞转染荧光标记的FAM-siRNA后,细胞内有绿色荧光表达。分别以10,30,50 nmol/L Survivin siRNA转染细胞后,细胞生长抑制率、Survivin mRNA表达、Survivin蛋白表达与空白对照组、阴性对照组、脂质体对照组比较差异有显著性(P<0.001)。细胞凋亡率与对照组比较明显下降(P<0.01)。随着Survivin siRNA浓度的增加,细胞抑制率与细胞凋亡率呈上升趋势,Survivin mRNA及Survivin蛋白的表达呈逐渐降低趋势。结论SurvivinsiRNA能抑制HUVEC的Survivin基因表达与并促进其凋亡。

Survivin siRNA抑制人腺样囊性癌ACC-2细胞移植瘤血管生成

目的观察siRNA抑制生存素survivin基因对裸鼠皮下人腺样囊性癌ACC-2细胞移植瘤血管生成的影响。方法裸鼠15只完全随机分为3组(n=5):①干扰质粒组,皮下接种survivinRNA干扰质粒转染的ACC-2细胞;②瘤体注射组,皮下接种正常ACC-2细胞15d成瘤后,将针对survivin的siRNA真核表达载体脂质体法作瘤体内及瘤周注射;③肿瘤细胞组,皮下接种正常ACC-2细胞。25d后处死全部裸鼠,剥离瘤体,测量瘤体体积,RT-PCR检测瘤体组织VEGFmRNA表达,HE染色和免疫组化染色法观察VEGF阳性染色及其微血管参数。结果干扰质粒组和瘤体注射组VEGF电泳条带的相对光密度比值(0.698±0.023、0.612±0.038)及总体微血管密度[(4.98±1.43)、(5.08±1.29)个]、有腔微血管密度[(2.98±1.05)、(3.10±1.23)个]、有腔血管周长[(68.60±15.98)、(70.12±14.19)μm]及管腔面积[(4119.14±698.12)、(4339.67±599.76)μm2]较肿瘤细胞组VEGF电泳条带的相对光密度比值(0.912±0.039)及总体微血管密度[(8.90±1.36)个]、有腔微血管密度[(5.89±1.68)个]、有腔血管周长[(129.48±25.68)μm]及管腔面积[(6952.74±1298.54)μm2]低(P<0.05),而干扰质粒组和瘤体注射组无明显差别(P>0.05)。结论 survivinsiRNA能够抑制腺样囊性癌瘤体生长,并在体内通过抑制腺样囊性癌VEGF表达有效减少肿瘤血管生成。

脂质体转染survivin siRNA对A549细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨脂质体转染survivin siRNA对人肺腺癌A549细胞增殖、凋亡的影响。方法:人工合成抑制survivin基因的siRNA片段,通过脂质体转染到A549细胞内,倒置荧光显微镜下观察细胞形态学变化;用四氮唑盐(MTT)法观察转染后24h,48h,72h对细胞增生的影响;流式细胞术检测各组细胞周期变化和凋亡指数;RT-PCR检测survivin mRNA的表达。结果:转染siRNA后的A549细胞,细胞增殖受到显著抑制,细胞明显出现凋亡,survivin基因mRNA表达显著下降。结论:应用RNA干扰靶向抑制survivin基因可以显著抑制A549细胞增殖,促进细胞凋亡。survivin可能成为肺癌基因治疗的一个新靶点。

厄洛替尼及Survivin siRNA与非小细胞肺癌

肺癌是全世界癌症死因的首位,非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌的80%以上。约65%的肺癌患者确诊时已属晚期,失去手术机会,最主要的治疗是化疗。尽管采用了手术、放疗和化疗等综合治疗措施,由于转移和多药耐药等原因,NSCLC的5年生存率仍低于10%。