猪溶菌酶在大肠杆菌中的表达及其复性

作为C型溶菌酶的一种,猪溶菌酶(Sus scrofa lysozyme,SSL)是猪体内抵抗外源性疾病的一道重要屏障。鉴于猪在畜牧行业中的重要地位,尤其是在饲用抗生素的使用严重受限的今天,SSL的生产显得尤为迫切。化学合成得到了SSL的编码基因,通过Bam HⅠ和HindⅢ双酶切之后与载体p ET-28a(+)连接,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。在25℃、200 r/min条件下,利用0.1 mmol/L的IPTG诱导8 h,离心发酵液获得菌体。对其进行超声破碎获得重组蛋白包涵体,然后对包涵体进行复性,最终获得了具有生物活性的目的蛋白,并对其酶学性质以及抗菌活性进行了研究。超声破碎后获得了181.05 mg/L的重组蛋白包涵体,对包涵体进行复性后,比酶活力可达8 032.78 U/mg,其最适温度为35℃,最适p H为6.0,与其理论值基本一致,而其抗菌活性与标准品溶菌酶的作用效果也比较类似,为其规模化生产与进一步应用奠定了理论基础。

融合表达HLH结构域对猪溶菌酶抗菌活性的影响

[目的]通过遗传操作提高猪溶菌酶抗革兰氏阴性菌的活性。[方法]对猪溶菌酶进行分子模拟,得到了包含功能肽的螺旋-回环-螺旋(HLH)结构域,将HLH编码基因与猪溶菌酶基因N端或C端进行融合,于大肠杆菌中诱导表达,经复性、纯化后检测其抗菌活性,并利用原子力显微镜和荧光染色对抗菌活性较高的融合蛋白杀菌机制进行初探。[结果]与对照组相比,N端和C端融合蛋白基本保持了猪溶菌酶对革兰氏阳性菌的活性;同时,两种融合蛋白对革兰氏阴性菌的抗菌活性均显著增强,其中N端融合产物活性更高,它对大肠杆菌ATCC 10798、大肠杆菌ATCC 25922、克雷伯氏菌TR5、铜绿假单胞菌ATCC 15442、沙门氏菌CMCC(B)50335的抗菌系数分别为1.64、1.24、2.56、1.72和1.42,最低抑菌浓度分别为90μg/mL、100μg/mL、40μg/mL、80μg/mL和100μg/mL。经检测,该融合蛋白能显著增强革兰氏阴性菌细胞膜的通透性。[结论]通过融合表达自身来源的HLH结构域,猪溶菌酶抗革兰氏阴性菌活性得到了显著提升,可为其它溶菌酶抗菌活性的提高提供参考。

一种猪溶菌酶来源的抗菌六肽的分离鉴定及其性质

为提高猪溶菌酶(Sus scrofa lysozyme,SSL)的抗革兰氏阴性菌活性,将其进行了不同蛋白酶的水解,选择抗革兰氏阴性菌效果最好的水解产物,利用凝胶过滤色谱和反相制备色谱进行分离,对其功能成分进行液质联用鉴定。对分离得到的物质进行抗菌活性验证和生物信息学的分析,并在此基础上对抗菌物质的杀菌机理进行了探讨。结果表明,胰蛋白酶的水解产物具有较高的杀灭革兰氏阴性菌的活性,进一步分离纯化得到了具有抗革兰氏阴性菌活性的六肽A-W-V-A-W-K。经化学合成验证,该六肽既保留了SSL的部分抗菌活性,也具备杀灭多种革兰氏阴性菌的能力。进一步分析发现其位于SSL分子C端的一个螺旋-回环-螺旋的结构中,并由此推测其杀菌机理是通过改变细胞膜的渗透性,进而使细胞内溶物流出而造成细胞死亡,而抗菌实验也验证了这一推测。该抗菌肽的发现为后续提高SSL的抗菌活性提供了理论依据。