甘薯4种RNA病毒多重RT-PCR检测方法的建立

针对甘薯生产上发生为害严重的甘薯RNA病毒-甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)、甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)、甘薯G病毒(SPVG)和甘薯C病毒(SPVC),建立了多重RT-PCR检测方法。首先根据GenBank中收录的这些病毒的外壳蛋白(CP)基因的保守序列,利用Premier 5.0软件分别设计并合成了上述4种病毒的特异性引物;以4种病毒的下游特异性引物合成的cDNA为模板,在同一体系中同时加入上述4种甘薯病毒引物进行PCR扩增,初步建立这4种甘薯RNA病毒的最佳多重RT-PCR体系;通过对该多重RT-PCR体系的退火温度、延伸时间、dNTPs量、模板量、引物浓度等条件的优化,建立了能够同时检测这4种甘薯RNA病毒的最优四重RT-PCR检测体系,并对优化的多重RT-PCR体系进行了挑战测试和灵敏度测试。试验结果显示,优化的多重RT-PCR体系,各病毒引物之间不会出现交叉干扰,所扩增的4条目的条带清晰,能够明确区分上述4种甘薯病毒;挑战检测和灵敏度测试显示,此检测体系特异性强且灵敏度高。所建立的上述4种甘薯RNA病毒的多重RT-PCR检测方法能同时检测4种甘薯病毒,不仅准确灵敏,而且降低了检测成本,提高了病毒检测效率。

甘薯病毒C中国分离物全基因组序列测定及比较分析

利用RT-PCR结合RACE方法,从采自河南南阳的甘薯样品上获得甘薯病毒C中国分离物(SPVC-Ch1)的全长基因组序列。序列分析结果表明,SPVC-Ch1基因组由1 0846个核苷酸组成,3'末端包含poly(A)尾序。基因组含有1个由10 446个核苷酸构成的开放阅读框,编码一个由3 481个氨基酸残基构成的393 k Da多聚蛋白。将SPVC-Ch1与Gen Bank中登录的其他SPVC分离物序列进行比较分析发现,SPVC不同分离物间全基因组核苷酸序列相似性为92.7%~98.9%,多聚蛋白的氨基酸序列相似性为95.1%~99.2%,SPVC-Ch1与Bungo分离物的相似性最高,与C1分离物的相似性最低。系统进化树分析结果表明,SPVC-Ch1与日本的Bungo、以色列的IL、韩国的CW135和UN202等分离物形成一个分支,亲缘关系较近。这是SPVC中国分离物全基因组序列的首次报道,研究结果丰富了SPVC全基因组序列信息,有助于全面了解SPVC种群的遗传进化关系。