植物SWEET基因家族的相关研究进展

为了深入研究近年来新发现的一类糖转运蛋白SWEET基因家族在植物中的作用,本研究介绍了植物SWEET基因家族的发现,归纳总结了SWEET基因的蛋白质结构、进化分析结果和在植物中的生理功能。指出SWEET转运蛋白具有多种不同的生理功能,在植物生长发育及代谢活动中起了重要的作用。为后续在植物中研究SWEET基因家族提供一定的理论基础。

基因工程表达甜味蛋白的研究进展

甜味蛋白作为一种天然甜味剂,热量低,甜度大,食用安全。但其由于受到原材料生长条件还有保质期等诸多限制,导致其生产成本较高。基因工程表达生产甜味蛋白可以提高其稳定性,扩大生产规模,降低其生产成本,并且更有针对性的改良其性能。但在应用基因工程生产甜味蛋白的研究中,也遇到了很多问题,包括甜味蛋白无法正确折叠及缺乏翻译后修饰导致的甜味丧失,还有因非植物提取导致的缺少食品安全认证,无法得到大众认可等。本文首次系统地分析了基因工程在生产甜味蛋白的应用及相关热点问题,为未来基因工程改造甜味蛋白提供理论资料。

甜蛋白基因MBLII对番茄的遗传转化

以5～7d龄的 丽春 番茄无菌苗子叶作为外植体,研究了子叶外植体对抗生素卡那霉素的敏感性,抗生素卡那霉素对番茄筛选的适宜浓度为70mg/L.通过根癌农杆菌 Agrobacteriumtumefaciens 介导,成功地进行了马槟榔甜蛋白基因MBLII对番茄的遗传转化,获得转化番茄抗性植株,组织化学法有阳性表现、PCR特异扩增及Southern杂交检测出现特异条带,表明MBLII基因已顺利整合到转基因番茄植株的基因组.

植物甜蛋白thaumatin基因重组表达质粒的构建

利用 DNA重组技术 ,将植物甜蛋白 thaumatin基因克隆至植物表达载体 p BI1 2 1中 ,成功地构建了重组植物表达质粒 p BI1 2 1

甜蛋白thaumatin基因高效植物表达载体的构建

根据thaumatin氨基酸序列及植物蛋白质表达密码子的偏爱性,设计了thaumatinⅠ的全基因序列引物,采用重叠延伸PCR法,人工合成了thaumatinⅠ全长基因,克隆至载体pMD19-T上,序列测序表明,克隆的DNA序列与原设计序列完全相同,利用表达载体pRI101-ON,构建了高效植物表达载体pRI101-thaumatin。

高效马铃薯遗传转化体系的建立及甜蛋白基因的导入

本研究选用了三个马铃薯(Solanum Iuberosum L.)栽培品种“85T-14-3”、“86-2”及“Favorita”的块茎、微型薯和试管薯为起始材料,应用根癌农杆菌 Ti 质粒系统成功地建立了一种方法简单、速度快和频率高的遗传转化体系。其中试管薯薄片的转化速度最快,经根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)共培养后,薄片在100mg/L 卡那霉素的分化培养上,2—3周就可产生出抗性小芽,这些小芽进一步仲长后可在50—100mg/L 卡那霉素的无激素MS 培养基上生根。从共培养到转化植株的获得只需6—7周。微型薯和试管薯的转化频率较高,最高可达67.5%。大多数抗性植株均能检测到胭脂碱合成酶或 GUS 基因的表达。把带有甜蛋白基因和胭脂碱合成酶标记基因的Ti质粒导入马铃薯,获得大量转化植株。叶片抗性检测和 nopaline 检测可推断外源甜蛋白基因已进入马铃薯基因组。

马槟榔MBLⅡ基因重组及果实特异表达载体构建

根据马槟榔(MBLⅡ)甜蛋白核酸序列及相应氨基酸序列的结构及功能预测,采用基因重迭延伸技术在编码A链和B链的序列间插入连接多肽LP4/2A,对MBLⅡ基因进行亚克隆并构建重组体.结果表明:试验克隆全长乙烯应答果实特异性E8启动子,构建了含除草剂抗性基因bar的E8启动子驱动的重组MBLⅡ基因植物表达载体pCA-E8-Mab,为实现甜蛋白基因在人参果果实中特异表达及改善风味奠定了基础.

甜椒细胞质小分子量热激蛋白基因(CaHSP18)的cDNA克隆与表达

用RT-PCR和RACE-PCR技术,从热激处理的甜椒叶片总RNA中扩增出了细胞质小分子量热激蛋白(sHSP)全长779bp的cDNA基因序列,包含一个480bp开放阅读框,编码159个氨基酸。Southern杂交结果表明在甜椒基因组中有该基因的小的多基因家族。Northern结果显示该基因在甜椒根、茎、叶中的表达受热激和低温的诱导。原核表达分析表明该基因在高温以及低温条件下可以提高大肠杆菌的生存能力。

甜椒CaHSP26的cDNA克隆与表达

用RT-PCR技术从热激处理的甜椒(Capsicum annuumL.)叶片中克隆了叶绿体小分子量热激蛋白(sHSP)基因的cDNA序列,其全长为917bp,命名为CaHSP26。Southern杂交分析表明该基因在甜椒基因组中为单基因。Northern杂交结果显示该基因在甜椒根、茎、叶中受高温诱导表达。高温(50℃)胁迫下,在大肠杆菌中异源表达CaHSP26可以维持大肠杆菌较高的细胞活力。这些结果表明在高温胁迫下植物叶绿体sHSP对细胞具有保护作用。

用重叠PCR合成植物甜蛋白brazzein基因

目的:为在泡盛曲霉(Aspergillus awamori)中进行表达,采用重叠PCR合成了植物甜蛋白brazzein基因。方法:根据非洲热带植物Pentadiplandra brazzeana产生的天然甜蛋白brazzein的氨基酸序列及泡盛曲霉糖化酶基因glaA的密码子偏爱性,设计并化学合成了2对3’-端互补的寡聚核苷酸,通过PCR延伸获得2条末端有部分重叠的双链核苷酸片段,再通过重叠PCR扩增,合成了用于泡盛曲霉表达的植物甜蛋白brazzein基因。结果:将brazzein基因克隆到pMD18-T载体,随机挑取6个重组质粒测序,结果1个重组质粒有连续4个碱基缺失,3个重组质粒各有1个碱基缺失,2个重组质粒携带的brazzein基因核苷酸序列完全正确。结论:合成的brazzein基因大小162 bp,编码54个氨基酸,推断的氨基酸序列与Pentadiplandra brazzeana产生的天然brazzein完全一致,表明植物甜蛋白brazzein基因成功合成。

植物甜蛋白Mabinlin Ⅱ B亚基cDNA的克隆与序列分析

依据MabinlinⅡB亚基N端与C端氨基酸序列设计两个简并引物。从马槟榔（CapparismasaikaiLevl．）种子中提取总RNA。经反转录合成cDNA第一链，以此为模板进行多聚酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）产物为近22bp的DNA片段。经克隆及序列测定结果表明，该片段为MabinlinⅡB亚基cDNA的185bp。

甘薯羽状斑驳病毒中国分离株外壳蛋白基因的克隆和序列分析

根据已报道的甘薯羽状斑驳病毒(Sweetpotatofeatherymottlevirus,SPFMV)外壳蛋白基因序列,设计合成了一对特异性引物,以我们从国内甘薯品种徐薯-18上分离到的SPFMV的RNA为模板,经过反转录合成cDNA第一条链,经PCR扩增、限制性酶切后克隆于pUC19的Hind 和SacI位点,转化大肠杆菌JM109,经限制性酶切分析、PCR鉴定以及序列分析证实获得了SPFMV中国分离株外壳蛋白基因的全长克隆.

甘薯潜隐病毒外壳蛋白基因的克隆、表达及其抗血清的制备

根据已报道的甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus,SPLV)外壳蛋白(CP)基因的核苷酸序列合成引物,利用RT-PCR方法克隆了SPLV河南分离物(SPLV-HN)的CP基因及部分3′端非编码区序列,序列分析表明,SPLV-HN CP基因由879个核苷酸组成(GenBank登录号为DQ399862),编码293个氨基酸残基。与GenBank中SPLV-CH(X84011)和SPLV-T(X84012)分离物的核苷酸序列相似性分别为96.8%和93.0%;与日本分离物(E15420)的核苷酸序列相似性为83.6%。将CP基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CP基因在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中得到了高效表达。以表达的蛋白为抗原,免疫家兔,制备了SPLV外壳蛋白的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间甘薯样品的检测。

甜蛋白的特性及其生物法生产

甜蛋白是一类新兴的、有巨大开发潜力的甜味剂,它具有低能量、不会引起龋齿等特性。本文综述了六种甜蛋白和一种甜味调节剂的生化特性,并对它们的应用现状和开发前景进行了论述。

Mabinlin基因分离与克隆中T－载体技术的应用

从采自云南屏边的马槟榔（ＣａｐｐａｒｉｓｍａｓａｉｋａｉＬｅｖｌ）叶片中分离提纯到ＤＮＡ，依据植物超甜蛋白Ｍａｂｉｎｌｉｎ的氨基酸序列，回译出Ｍａｂｉｎｌｉｎ的核苷酸序列，用简并密码子优先使用的原则和计算机ＤＮＡ系统分析，设计基因的上、下游引物，通过快速扩增得到Ｍａｂｉｎｌｉｎ基因的ＰＣＲ产物。用平末端内切酶ＥｃｏＲＶ和Ｓｍａｌ分别消化质粒Ｂｌｕｅｓｅｒｉｐｔ和Ｐｖｚ－１在标准缓冲液条件下，使用２ｍｍｏｌ／ＬｄＴＴＰ和Ｔａｑ多聚酶，７０℃温育２ｈ，反应中缺乏ｄＴＴＰ以外任何其它核苷酸均可导致线状载体３’端单－Ｔ的增加，此Ｔ－载体可用于Ｍａｂｉｎｌｉｎ基因的分离与克隆。其克隆效率比将ＰＣＲ扩增产物克隆到平末端载体上的效率高出１００倍以上。

植物甜蛋白基因Thaumatin Ⅱ转化番茄的初步鉴定

以番茄无菌苗的子叶为外植体,以抗卡那霉素的NPTⅡ作为选择标记基因,通过根癌农杆菌介导法,将甜蛋白Thaumatin Ⅱ基因导入番茄中,共获得10株独立的抗性转化株系。对抗性转化株系进行了PCR和Southern blotting鉴定,PCR检测得到了预期的特异条带,Southern blotting结果表明其中1个转化株系插入了2个拷贝的Thaumatin Ⅱ cDNA。以上试验结果证明Thaumatin Ⅱ基因已经整合到转基因番茄植株的基因组中,为最终获得在蛋白质水平表达Thaumatin Ⅱ的无选择标记的转基因番茄打下了基础。

甘薯褪绿矮化病毒外壳蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

克隆甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)外壳蛋白(CP)基因,构建其原核表达载体,并在大肠杆菌中进行诱导表达。根据已报道的甘薯褪绿矮化病毒西非(WA)株系基因组核苷酸序列设计引物,利用RT-PCR方法克隆了SPCSV四川分离物基因组RNA2上1 902bp大小的片段。序列分析表明,该片段包括部分p60基因序列、完整的p8基因和CP基因(major CP)序列及部分mCP基因(minor CP)序列。CP基因由774个核苷酸组成,编码257个氨基酸残基,与已发表的SPCSV WA株系Can181-9分离物相比,其核苷酸和氨基酸序列一致性分别为99.48%和99.22%。将CP基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CP基因在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达的融合蛋白分子量约为38kD,为SPCSV抗血清的制备及其血清学检测技术的建立奠定了基础。

台湾甜椒种子中辣椒轻斑驳病毒检测及其致病型鉴定

利用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和基因序列分析法对一批台湾进境的辣椒种子进行病毒检测及致病型鉴定,同时使用特征序列扩增区域(SCAR)标记引物利用PCR方法对该辣椒品种进行L抗性基因检测。DAS-ELISA及RT-PCR结果表明,从该批种子中检测到辣椒轻斑驳病毒(Peppe rmild mottle virus,PM MoV)。PCR产物测序分析表明,该序列为PM MoV的外壳蛋白(CP)基因,与已报道的PM MoV序列同源性为92.4%～99.8%。CP蛋白氨基酸序列分析表明,该分离物(命名为TW分离物)属于PM MoV的P1,2,3致病型。抗性基因检测表明,该辣椒品种携带有L3抗性基因。TW分离物能够系统侵染该辣椒品种,意味着该分离物已经克服L3基因介导的抗性。本研究报道的PM MoV的P1,2,3致病型在中国大陆尚属首次,这对于抗病辣椒品种的选育具有重要的指导意义。

马槟榔甜蛋白基因(MBLⅡ)的拼接与表达载体的构建

从云南植物Capparismasaikai中提取总DNA,设计引物克隆马槟榔甜蛋白基因MBLⅡ,序列测定后经同源性分析表明与GeneBank中登陆的马槟榔甜蛋白基因MBLⅡ(cDNA)序列一致,表明MBLⅡ不存在内含子序列。利用重叠区扩增基因拼接法(genesplicingbyoverlapextension,geneSOEing)进行体外基因剪接,剪接片段与植物表达载体pVKH相连,构建pVKH-35S-MBLⅡ-Pa、pVKH-35S-S-A+B-pA、pVKH-35S-A+B-pA、pVKH-35S-S-A-pA、pVKH-35S-S-B-pA,为寻找mabinlin的活性表达形式和翻译后剪接机制打下基础。

甜味蛋白研究的新进展

甜味蛋白 (thaumatin)是世界上已知最甜的物质 ,具有很大的应用前景 .Thaumatin的基因核苷酸和蛋白质氨基酸序列都已测定 .晶体分析表明它具有高稳定的四级结构 .在味蕾小孔中发现了介导thaumatin发生作用的物质 .Thaumatin自身的功能仍不清楚 .在多种生物中发现了thaumatin类似蛋白质 ,具有不同的生物活性 .用基因工程手段实现了thaumatin在多种原核和真核生物中的表达 。