扩张蛋白Swollenin基因香菇表达载体构建及其初步转化

构建含有Swollenin基因(swo基因)的香菇表达载体,并通过PEG(polyethylene glyeol)介导的原生质体转化法实现对香菇的遗传转化,转化效率约为1个转化子/μg质粒DNA。PCR和杂交检测结果表明,swo基因已经整合到香菇的基因组中;栽培实验结果表明,两个转化子都能正常出菇,而且转化子Ⅱ表现出优良的生物学性状,将swo基因转化到香菇中对香菇新品种的培育进行探索。

里氏木霉Swollenin在毕赤酵母中的表达

通过设计合适的引物,经RT-PCR方法从里氏木霉的总RNA中扩增出Swollenin基因,并将该基因连接到PMD18-T Simple载体,得到该基因的克隆菌株,经酶切并将该基因连接到巴氏毕赤酵母表达载体pPICZαA,得到重组质粒pPICZαA-swo1.将该重组质粒线性化后,通过电转化方法转化毕赤酵母GS115,得到重组菌株P.pastoris-swo1.该菌株的发酵液可使滤纸纤维强度降低,纤维素膨胀及崩解效果明显,表明重构表达的Swollenin可用于木质纤维素的预处理.

过表达内源Trswo1基因提高里氏木霉纤维素酶对玉米秸秆水解效率的研究

利用β-葡萄糖苷酶的转糖苷活性制备廉价葡萄糖-槐糖混合物(mixture of glucose and sophorose, MGD)作为诱导物被成功用于诱导里氏木霉(Trichoderma reesei)高效合成纤维素酶,但蛋白质组学显示相比于纤维素作为诱导物,膨胀素基因(Trswo1)显著性低表达导致纤维素酶水解效率低。因此利用组成型强启动子丙酮酸脱羧酶1(pyruvate decarboxylase1, PDC1)在T.reesei Rut C30中过表达内源Trswo1基因,2个T.reesei阳性转化子OEswo1-1和OEswo1-2的Trswo1基因转录水平分别提高了4.65倍和3.91倍,虽然T.reesei OEswo1-1和OEswo1-2在MGD诱导下合成的纤维素酶活性、内切纤维素酶活性和外切纤维素酶活性与野生菌酶活性均无显著性差异,但所产纤维素酶对玉米秸秆的水解效率分别提高了6.98%和13.93%。进一步通过X射线衍射(X-ray diffraction, XRD)和扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)显示水解效率提高主要是由于木质纤维素结晶度的降低,同时纤维结构有不同程度的疏松和崩解。该研究成果对T.reesei利用可溶性诱导物合成纤维素酶系中纤维素降解辅助蛋白含量低的问题具有一定意义。

重组里氏木霉膨胀素的生物学特性研究

微生物膨胀素在生物炼制行业具有重大潜在应用前途。开展了从重组里氏木霉膨胀素生物学特性测定的工作。研究了发酵液中膨胀素的生物活性,初步的生物活性测定显示,该蛋白单独使用不具水解纤维素活性,但在纤维素酶水解纤维素时表现出明显的协同活性。结果表明,温度和pH等因素对分离得到的swollenin蛋白活性影响较大,并确定了最适的pH和温度范围。

结晶纤维素的降解

随着化石能源的日益消耗及其对环境的污染加重,寻求可再生的清洁能源已成为各国关注的焦点。木质纤维素是地球上最多的有机聚合物,对于解决能源危机具有巨大的潜力,但没有得到有效的利用,纤维素结晶区的存在是阻碍其降解的重大难题。本文介绍了结晶纤维素的结构、解结晶方法及优良的降解菌种;纤维素酶的结构和功能;降解结晶纤维素的机制;纤维素酶的基因工程和酶工程改造。突出应加大对耐热、高效的结晶纤维素降解菌株的挖掘,并深入探究碳水化合物结合结构域的相关作用机理,这对结晶纤维素的高效降解具有重要意义。

冬小麦膨胀素基因EXPB7工程菌构建及纤维素水解作用分析

为了寻找促进纤维素降解的有效方法来提高纤维素酶的降解效率。本研究以东农冬麦1号膨胀素基因EXPB7为供体,构建黑曲霉表达载体,以黑曲霉CICC2462为受体,采用农杆菌介导法遗传转化黑曲霉,构建膨胀素基因黑曲霉工程菌pSZHGS-EXPB7,并对该工程菌发酵液的纤维素水解促进作用进行分析。结果表明,黑曲霉重组膨胀素蛋白在对滤纸处理2 d后崩解效果明显,与出发菌株的分泌蛋白相比,具有一定的促进作用;重组菌株发酵液上清处理滤纸产生的还原糖含量显著高于出发菌株(P<0.05),与仅用酶液处理滤纸相比,能够将纤维素酶的水解效率提高32.9%。

草酸青霉中一个膨胀因子基因POX06047的遗传分析

纤维素由于大量纤维素链间氢键的存在形成了很难被纤维素酶降解的微晶纤维素。膨胀因子通过破坏纤维素链间的氢键使纤维素酶能更好地接近和降解底物。草酸青霉(Penicillium oxalicum)HP7-1的基因组中注释为膨胀因子基因有4个,分别为POX01524、POX06047,POX07832和POX08485。其中POX06047被注释为类扩展蛋白(expansin-like)基因,通过结构域分析,POX06047含有一个类内切葡聚糖酶45家族结构域。本研究通过同源重组途径和冻融转化法在草酸青霉ΔPoxKu70菌株中将POX06047基因敲除,成功获得了缺失突变株ΔPOX06047。通过测定缺失突变株在液体产酶培养基下的各种纤维素酶产量和木聚糖酶产量,发现相比于出发菌株ΔPoxKu70,ΔPOX06047的CMCase产量和滤纸酶产量没有变化,而木聚糖酶产量、p-NPCase产量和p-NPGase产量均出现了不同程度的下降。将POX06047基因在草酸青霉ΔPoxKu70中进行过量表达,得到过量表达菌株OXPOX06047,检测结果表明,相比出发菌ΔPoxKu70,ΔPOX06047的p-NPCase、木聚糖酶产量有所提高,CMCase、p-NPGase产量有所下降,滤纸酶活力保持不变。