应用GFP质粒构建及转染技术探讨Syk(L)核移位机制

【目的】通过研究Syk(L)在乳腺癌细胞亚细胞器中的分布和移位机制,探讨Syk(L)抑制乳腺癌的可能性机制。【方法】采用细胞胞核、胞浆分离技术和Westernblot的方法,检测乳腺癌细胞系BT474中两种Syk蛋白异构体在细胞内的分布。构建绿色荧光蛋白(GFP)和Syk(L)核移位相关功能域融合蛋白质粒,转染入Cos7细胞内,荧光显微镜下观察融合蛋白在细胞内的分布。【结果】BT474细胞的细胞浆中可检测到Syk(S)和Syk(L)的表达,细胞核中只检测到Syk(L)的表达。在Cos7细胞中,GFP与Syk(L)的缺失域(deletiondomain,DEL域)融合蛋白均匀分布于细胞内,GFP与Syk(L)的IDB域融合蛋白聚集于细胞核中;将DEL域上的294K、300K、及305K突变域非碱性氨基酸后构建成GFP-IDB(L)-M,突变的融合蛋白则失去核聚集现象。【结论】在乳腺癌细胞中,Syk(L)可从细胞胞浆移位到细胞核内。Syk(L)的IDB域具有完整的核移位功能,能将融合的胞浆蛋白GFP转移到细胞核内;DEL域的碱性氨基酸具有核定位信号功能。Syk(L)在乳腺癌细胞中的抑癌功能与其核移位有关。

抑癌基因Syk(L)在乳腺癌中具有转录抑制因子功能

目的:研究移位到细胞核内抑癌基因Syk(L)在乳腺癌中的生物学功能,探讨Syk(L)抑制乳腺癌发展的可能机制。方法:将Syk(L)、失去激酶活性的Syk(L)以及Syk(L)各个功能域按正确读框插入到含有Gal4基因DNA结合功能域(Gal4-DBD)的pFA载体中,并在HEK293细胞中表达;利用Gal4荧光素酶报告基因的方法检测在乳腺癌细胞中Syk(L)、失去激酶活性的Syk(L)以及Syk(L)各个功能域对基因转录的影响。结果:在乳腺癌细胞MB231和MB435中,与Gal4-DBD结合的Syk(L)可以下调启动子上含有Gal4结合位点的萤光素酶基因的表达,这种调节与Syk(L)的激酶活性无关,是通过Syk(L)的SH2功能域和KD功能域完成的。结论:在乳腺癌中,Syk(L)具有转录抑制功能,该功能与Syk(L)的激酶活性无关,是通过Syk(L)的SH2功能域和激酶功能域实现的。Syk(L)在乳腺癌中的抑癌作用可能与其转录抑制功能有关。

全长型脾酪氨酸激酶对肝细胞癌侵袭和转移的抑制作用

【目的】本研究通过检测肝癌组织中全长型脾酪氨酸激酶SYK(L)的表达、与临床病理因素的相关性分析、以及细胞学实验等方法,探讨SYK(L)对肝癌侵袭与转移的影响。【方法】采用免疫组织化学方法检测211例肝癌组织及其匹配癌旁肝组织中SYK(L)的表达,分析其与临床病理因素的相关性;细胞学实验检测SYK(L)对肝癌细胞侵袭性的影响;并在临床标本中进一步验证SYK(L)与MMP9蛋白表达的相关性。【结果】211例肝癌组织中SYK(L)表达(41.2%,87/211)低于癌旁肝组织(92.4%,195/211)(P<0.001);肝癌SYK(L)表达与术前AFP水平(P=0.012)、肿瘤直径(P=0.034)、卫星结节(P=0.015)、血管侵犯(P=0.003)和细胞分化程度(P=0.005)相关。Transwell小室侵袭性实验提示SYK(L)可抑制肝癌细胞的侵袭能力,且半定量RT-PCR检测发现SYK(L)可下调MMP9和MMP2 mRNA的表达水平。在211例肝癌组织中,SYK(L)与MMP9表达存在显著负相关(r=-0.601,P<0.001)。【结论】肝癌中SYK(L)蛋白表达降低;SYK(L)可能通过抑制肝癌细胞的侵袭与转移,抑制肝癌的发生发展。

肝细胞癌中全长型脾酪氨酸激酶的表达及其预后价值

【目的】脾酪氨酸激酶(SYK)有两种蛋白异构体的存在,全长型SYK(L)和缩短型SYK(S),两者在恶性肿瘤中功能不同;肝癌中SYK(L)功能未见报道。本研究通过定制的SYK(L)特异性多克隆抗体,检测其在肝细胞癌组织中的表达,探讨SYK(L)表达与肝癌患者临床病理因素及预后关系。【方法】定制SYK(L)的特异性抗体,采用免疫组化方法检测162例肝癌患者的肿瘤组织及其癌旁肝组织SYK(L)蛋白的表达情况,分析其与临床病理因素及患者术后生存的关系。【结果】定制SYK(L)抗体的特异性良好;肝癌组织中SYK(L)阳性率为64.8%(105/162),低于癌旁肝组织98.1%(159/162)(P<0.001);SYK(L)表达与肿瘤大小、肿瘤分化程度、有无卫星结节和血管侵犯相关(P<0.05)。肿瘤中SYK(L)蛋白阳性表达肝癌患者的术后无复发生存与总体生存明显长于阴性表达者(P<0.001)。多因素Cox回归模型显示,SYK(L)表达状态是肝癌患者无复发生存期与总体生存期的独立危险因素之一(P<0.001)。【结论】肝癌组织中SYK(L)蛋白表达减低,与肿瘤分化、侵袭转移和预后相关;SYK(L)可作为判断肝癌患者预后的有效分子标志物。

全长型脾酪氨酸激酶基因转染对人喉鳞癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用

目的探讨全长型脾酪氨酸激酶[full-length spleen tylosine kinase,SYK(L)]基因转染对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤生长的影响。方法建立人喉鳞癌Hep-2细胞裸鼠皮下移植瘤模型,分为SYK(L)重组质粒转染组、阴性对照质粒转染组和生理盐水组,分别向瘤体内注射SYK(L)重组质粒p IRES2-EGFP-SYK(L)及脂质体混合物、阴性对照质粒p IRES2-EGFP及脂质体混合物和生理盐水,观察肿瘤生长情况。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real time fluorescence polymerase chain reaction,Q-RT-PCR)、Western blot法检测各组瘤体内的SYK(L)mRNA及蛋白表达水平。结果 SYK(L)重组质粒转染组的肿瘤平均体积为367.61±81.23mm3,明显小于阴性对照质粒转染组900.20±131.41mm3及生理盐水组930.71±143.73mm3,差异有统计学意义(F=99.91,P<0.01);Q-RT-PCR结果显示SYK(L)重组质粒转染组瘤体内mRNA相对表达量为2.268±0.075,明显高于阴性对照质粒转染组(1.212±0.025)及生理盐水组(1.175±0.031)(F=102.01,P<0.01);Western blot法检测结果显示SYK(L)重组质粒转染组瘤体内相对蛋白含量(0.834±0.021)明显高于阴性对照质粒转染组(0.243±0.041)和生理盐水组(0.301±0.039),差异有统计学意义(F=104.13,P<0.01)。结论全长型脾酪氨酸激酶基因转染对人喉鳞癌裸鼠移植瘤有明显的生长抑制作用,有望成为基因治疗喉癌的新靶点及途径。