Advance of entomopathogenic nematodes

This paper summarized the history and present condition of studying and utilizing entomopathogenic nematodes at home and abroad, expounded its taxonomy, life cycle and the mechanism with symbiotic bacteria killing host insect. Taxonomy, mycelial form, pathogenic function and anti-bacteria function of symbiotic bacteria were introduced. Production and utilization of entomopathogenic nematodes, the characteristic genetic improvement by use of biological engineering technology, as well as the existing problem and applying foreground were also discussed.

昆虫病原线虫共生菌及代谢产物对根结线虫的防治作用

为探讨不同种昆虫病原线虫(EPN)共生菌对根结线虫病的防治效果,开展了温室盆栽定量接种试验;为明确EPN共生菌的代谢产物对根结线虫卵孵化和二龄幼虫活性的影响,进行了室内生测试验。结果表明,Meloidogyne incognita(M.incognita)在中蔬4号番茄上接种剂量为1000、2000和5000个卵·株^(−1)时,昆虫病原线虫共生菌Xb-IGA和Pl-IGA对M.incognita卵的繁殖均有较好的抑制效果,抑制效果为59.4%~73.9%。Meloidogyne hapla(M.hapla)在VFNT番茄上接种剂量为2000个卵·株^(−1)时,昆虫病原线虫共生菌Pl-IGA对M.hapla卵的繁殖抑制效果最好,可达74.5%,与常规药剂阿维菌素(82.2%)差异不显著。4种EPN共生菌均能有效降低M.incognita和M.hapla侵染后的发病程度,对番茄根部生长有不同程度的促进作用。在生测试验7 d时,4种昆虫病原线虫共生菌代谢产物的2倍稀释液和5倍稀释液对M.incognita和M.hapla卵孵化抑制率为55.1%~94.8%,对M.incognita二龄幼虫校正死亡率为34.2%~47.8%,对M.hapla二龄幼虫校正死亡率为59.6%~79.9%。因此,昆虫病原线虫共生菌及其代谢产物对根结线虫是非常有潜力的生物杀线虫资源。

胰岛素对昆虫病原线虫卡森斯氏线虫0657L生长发育及其共生细菌伯氏致病杆菌0657L的影响

【目的】为探讨胰岛素对昆虫病原线虫卡森斯氏线虫Steinernema kraussei 0657L生长发育及其共生细菌的影响。【方法】吸取1.5 mL 3000头/mL的卡森斯氏线虫0657L悬浮液侵染大蜡螟Galleria mellonella 3龄幼虫,25℃培养24 h后分离卡森斯氏线虫0657L的共生细菌伯氏致病杆菌Xenorhabdus bovenii 0657L;分别用1∶500胰岛素和1∶5000胰岛素处理伯氏致病杆菌0657L后饲喂卡森斯氏线虫0657L,借助体视显微镜观测伯氏致病杆菌0657L在胰岛素处理1~6 d时的菌落直径并计算生长速率,计算卡森斯氏线虫0657L寿命、存活率、每30 s头部摆动次数和每30 s吞咽次数,评价其平均寿命、运动能力及吞咽能力。【结果】与空白对照组相比,1∶5000胰岛素和1∶500胰岛素处理组伯氏致病杆菌0657L的菌落直径在对数生长期(处理2 d时)可分别增大77.2%和54.0%,生长速率可由空白对照组的68.0μm/d分别提高至120.4和104.7μm/d;卡森斯氏线虫0657L寿命分别延长27.3%和45.5%;卡森斯氏线虫0657L 3龄幼虫每30 s头部摆动次数分别提高56.3%和74.7%,3和4龄幼虫及成虫每30 s吞咽次数分别提高50.9%和65.5%,26.8%和35.2%及23.7%和21.1%。【结论】胰岛素可以显著促进卡森斯氏线虫0657L共生细菌伯氏致病杆菌0657L单菌落的生长和提高其生长速率,能够通过伯氏致病杆菌0657L间接延长卡森斯氏线虫0657L的寿命,提高昆虫病原线虫的运动和吞咽能力。本研究结果可以为延长昆虫病原线虫商品货架期提供科学依据,为昆虫病原线虫的高效生物防治提供理论基础。

基于转录组学分析Xenorhabdus bovienii肽基脯氨酰异构酶ppia-l20基因的表达调控

[目的]前期从广谱抗菌的Xenorhabdus bovienii NN6菌株的胞外蛋白中分离出一种新型杀菌蛋白PPIA-L20,为肽基脯氨酰异构酶A类似物,该蛋白能够抑制尖孢镰刀菌西瓜专化型的孢子的萌发,致使孢子死亡。经过多次试验验证ppia-l20基因的表达水平不稳定,与发酵时间没有明显的相关性。本文旨在探寻调控ppia-l20基因表达的调控因子,进而推测ppia-l20基因表达调控的分子机制,为进一步提高抗菌蛋白的产量提供参考。[方法]对ppia-l20的转录水平进行Real-time PCR分析并与菌株生长曲线进行相关性分析,选择ppia-l20基因表达量差异显著的2个发酵时间点进行转录组学比较,并对表达差异显著的DEG(differential expressed gene)进行GO功能注释、KEGG富集通路和蛋白网络互作分析。[结果]4~84 h发酵菌体中的ppia-l20基因表达趋势不稳定,其转录水平与时间不相关。与ppia-l20低表达量的8 h发酵菌体相比,ppia-l20高表达量的12 h发酵菌体中有466个DEG,包括193个上调基因和273个下调基因。Real-time PCR验证表明基因表达差异趋势与转录组测序结果一致,证明测序结果可信。对差异表达的基因进行GO功能注释、KEGG富集分析,发现DEG的功能与膜形成相关,富集通路与双组分调节系统、磷酸转移酶系统和阳离子抗菌肽抵制通路相关。其中,双组分调节系统中的qseC基因和opmR基因表达量均上调2倍,ppia-l20基因位于阳离子抗菌肽抵制通路,该通路上的nlpE基因(负责编码外膜脂蛋白)显著下调。蛋白互作网络中,PPIA-L20蛋白与位于外膜的AMP结合蛋白TycC、GrsB有互作关系,NlpE蛋白与双组分调节系统中cpxR基因、cpxA基因表达的蛋白有互作关系。[结论]Xenorhabdus bovienii NN6菌株可能通过双组分调节系统通路、阳离子抗菌肽抵制通路上的关键基因nlpE和磷酸转移酶系统共同调控ppia-l20的表达。

昆虫病原线虫对昆虫致病机制的研究进展

本文综述了近年来昆虫病原线虫及其他共生菌对宿主昆虫致病机制的研究进展,从昆虫病原线虫对宿主组织、血淋巴、毒素和次生代谢的影响角度分别阐述,以期为研究新型的相关害虫防治方法及可持续开发利用昆虫病原线虫提供参考依据。

昆虫病原线虫共生菌筛选及其发酵液抑菌活性初步研究

对分别采自陕西杨凌、汉中、渭南、太白4地区的315份土样进行了昆虫病原线虫筛选及其共生菌分离,得到2种昆虫病原线虫及1株Ⅰ型昆虫病原线虫共生菌。Ⅰ型昆虫病原线虫共生菌经初步鉴定为致病杆菌属(X enorhabdus)的嗜线虫致病杆菌种(X enorhabdus nem a toph ilus)内的一个变种;对其抑菌活性研究结果表明,Ⅰ型昆虫病原线虫共生菌发酵液对植物病原真菌菌丝生长具有不同程度的抑制作用,其中对小麦纹枯病菌与辣椒疫霉病菌有强烈的抑制作用,对番茄灰霉病菌孢子萌发有延缓作用。

昆虫病原线虫共生菌YL001细胞内代谢产物抑菌作用研究初报

以生物活性跟踪法测定了菌株代号为YL001的昆虫病原线虫共生菌Xenorhabdus nemato-philus细胞内代谢产物的不同溶剂提取物及其不同馏分的抑菌活性。结果表明,YL001细胞内代谢产物的乙醇提取物和甲醇提取物的抑菌活性均高于石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物,前两种提取物对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea和辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici的72h菌丝生长抑制作用最强,在0.4mol/mL浓度时抑制率均达100%。乙醇提取物经硅胶柱层析分离,洗出液合并后收集得到8个馏分。测定了各馏分对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制作用,结果表明:馏分F6的抑菌活性最高,在0.5mol/mL浓度时,96h的菌丝生长抑制率可达96.09%;提取物的活性段主要集中在馏分F6、F7和F8。活体组织法测定结果表明,其乙醇提取物在10mg/mL的剂量下对番茄灰霉病的保护效果为64.81%,治疗效果为62.03%。

新疆嗜菌异小杆线虫及其共生细菌的初步鉴定研究

【目的】分离获得新疆地区的昆虫病原线虫及其共生细菌,确定其种属及共生细菌的分类地位,为新疆利用昆虫病原线虫进行生物防治害虫提供新的选择和奠定基础。【方法】采用黄粉甲(Tenebrio molitor)幼虫为诱导昆虫,采用Whitetrap法收集侵染期线虫,通过致死的昆虫血腔和侵染期线虫直接分离共生细菌,利用18S rRNA与形态鉴定初步确定昆虫病原线虫的种属,利用16S rRNA与形态初步确定其共生细菌的分类地位。【结果】从新疆伊犁州尼勒克县一山区牧场林带土壤中分离出一种能够有效致死黄粉甲幼虫的昆虫病原线虫,经初步鉴定其属于异小杆属线虫,与嗜菌异小杆线虫进化距离最近,初步命名为嗜菌异小杆线虫尼勒克品系(Heterorhabditis bacteriophora strain Nileke);分离出其共生细菌,初步鉴定为Photorhabdus luminescens(NLK-1),但无荧光。【结论】在新疆本土成功分离出一种异小杆属昆虫病原线虫及其共生细菌,初步确定了其种属,为在新疆本土开展以昆虫病原线虫为主的生物防治害虫提供了新的选择及途径,为开展本地区更广泛的分离筛选奠定了基础。

不同昆虫寄主对昆虫病原线虫共生菌的敏感性比较

用菜青虫、棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、粘虫、黄粉虫等 6种昆虫对 1 0株昆虫病原线虫共生菌进行了敏感性测定。结果表明 :供试菌株对 6种昆虫都有胃毒活性 ,不同菌株对同一种昆虫的毒力差别较大 ,同一菌株对不同昆虫差别也很大。 1 0株菌在 1 2 0h对菜青虫的校正死亡率和体重抑制率均最高 ,显然是最敏感的寄主。在 1 0株共生菌中 ,XenorhabdusnematophilaHB3 1 0 5 9菌株的胃毒活性最高。

昆虫病原线虫共生菌对玉米螟幼虫的杀虫活性

本研究自5个昆虫病原线虫品系离体培养得到35株共生细菌菌株 ,生物测定结果表明:SteinernemaSsy3线虫品系的共生菌对玉米螟(Ostriniafurnacalis)幼虫有较高的胃毒毒力 ,对存活虫的生长发育有明显的抑制作用。对高毒力菌株相关因子的研究表明 :高毒力菌株Ssy-1B经50℃处理10min及18W紫外灯下60cm高度垂直照射60min杀虫活性仍很稳定 ;Ⅰ、Ⅱ型共生菌对大蜡螟(Galleriamellonella)

昆虫病原线虫共生菌对水稻恶苗病菌的抑菌活性及其抗逆性的研究

利用不同品系昆虫病原线虫的共生菌菌株对水稻恶苗病菌进行抑菌活性测定,得到一株抑菌效果良好的共生菌菌株NC34-1,抑菌圈平均半径为17.33mm,并对高毒力菌株的抗逆性(包括不同温度、紫外照射)进行了初步探索,结果表明,共生菌菌株NC34-1在50℃高温下处理10min,其抑菌活性依旧很高;18W紫外线照射120min对共生菌NC34-1的抑菌活性的影响不明显,于LB培养基、160r/min、28℃培养40h时抑菌效果最佳。

昆虫病原线虫共生细菌对植物病原菌的抑制作用

昆虫病原线虫共生细菌能够产生多种次生代谢产物,如抑菌物质、杀虫蛋白和胞外酶等。其中产生抗生素是共生细菌的普遍特征,并且其代谢产物对多种植物病原菌具有抑制作用,特别是对疫霉具有较好的拮抗作用。对共生细菌的有效抑菌成分进行分离提取,有助于发现新的抗生素。本文综述了昆虫病原线虫共生细菌对植物病原菌的抑制作用以及抑菌作用活性物质的种类、致病机理、产生条件等方面的研究进展。

昆虫病原线虫的共生细菌

昆虫病原线虫与其共生细菌二者互惠共生 :共生细菌需要昆虫病原线虫作为载体以寄生寄主昆虫并做为自己的营养来源 ,而昆虫病原线则需要依靠共生细菌来杀死昆虫。综述了共生细菌的病原作用、抗菌作用与杀虫作用 ,评述了共生细菌的基因工程进展 ,讨论了昆虫共生细菌在昆虫病原线虫致病性的作用。

三株昆虫病原线虫共生菌胞外产物的抑菌活性

采用生长速率法、孢子萌发法、活体组织法和盆栽试验对3株昆虫病原线虫共生菌胞外产物甲醇提取物的抑菌活性进行了系统研究。结果表明,3个菌株甲醇提取物对番茄灰霉病菌、辣椒疫霉病菌、油菜菌核病菌的菌丝生长,对番茄灰霉病菌、玉米大斑病菌、稻瘟病菌、白菜黑斑病菌、杨树溃疡病菌、小麦根腐病菌的孢子萌发均有很强抑制作用。其中嗜线虫致病杆菌YL001菌株对辣椒疫霉病菌菌丝生长的抑制作用最强,EC_(50)为35.11mg/L;伯氏致病杆菌YL002菌株对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制作用最强,EC_(50)为42.16mg/L;嗜线虫致病杆菌TB菌株对油菜菌核病菌菌丝生长的抑制作用最强,EC_(50)为18.95mg/L。3个菌株甲醇提取物对玉米大斑病菌孢子萌发都有很强的抑制作用,EC_(50)分别为28.03、36.77和26.40mg/L。3个菌株甲醇提取物在1000mg/L浓度下,对离体番茄果实灰霉病的治疗和保护效果均在70%以上;对盆栽番茄灰霉病和辣椒疫霉病的治疗和保护效果均在65%以上。

2株昆虫病原线虫共生菌的分离与初步分类鉴定

从陕西杨凌采集的昆虫病原线虫S teinernem a sp.YL 001和S teinernem a sp.YL 002肠道内分别分离到1株具有较高杀虫和抑菌活性的共生菌菌株YL 001和YL 002,并对其从形态特征、培养特性及生理生化特征等方面进行了鉴定。结果表明,YL 001和YL 002菌株分别为嗜线虫致病杆菌(X enorhabdus nem a toph ila)和伯氏致病杆菌(X enorhabdus bov ien ii)。

昆虫病原线虫共生菌对小麦根腐病菌和小麦赤霉病菌的抑菌活性

为探索小麦根腐病和小麦赤霉病可持续控制的有效生防途径,以小麦根腐病菌和小麦赤霉病菌作为供试真菌,评价了昆虫病原线虫共生菌及其毒素的抑菌活性,并对高毒力菌株抗逆性进行了初探。结果表明,供试的28个昆虫病原线虫共生菌发酵液和毒素均有一定的抑菌活性,其中,高毒力共生菌菌株SY5发酵液和毒素对小麦根腐病菌的抑菌率分别为56.05%和67.41%,对小麦赤霉病菌的抑菌率分别为82.41%和83.32%;菌株SY5发酵液经50℃处理60 min及18 W紫外灯照射120 min后对小麦根腐病菌的抑菌率无明显变化,但对小麦赤霉病菌的抑菌率有所下降;常温保存150 d,抑菌活性略有下降。说明共生菌菌株SY5对小麦根腐病菌和小麦赤霉病菌抑菌活性显著,且具有一定的抗逆性,极具应用潜力。

共生菌杀虫毒素对小菜蛾和甜菜夜蛾的杀虫活性

利用从全国采集的土样中收集到28个品系的昆虫病原线虫,分离并筛选出28株共生菌高毒力菌株,对高毒力菌株的杀虫毒素进行初步提取,并以小菜蛾和甜菜夜蛾作为供试昆虫,对其杀虫活性进行测定。结果表明,共生菌的杀虫毒素粗提物对两种害虫的1龄幼虫均有一定的杀虫活性,其中菌株5-5B的杀虫效果最为明显,处理后120h,小菜蛾和甜菜夜蛾的平均校正死亡率分别为100%和68.52%。

昆虫病原线虫共生菌对香蕉灰纹菌的影响研究

利用不同品系昆虫病原线虫的共生菌菌株对香蕉灰纹菌进行抑菌活性测定,得到一株抑菌效果良好的共生菌菌株0385D,抑菌圈平均半径为17.33mm,并对高毒力菌株的抗逆性(包括不同温度、紫外照射)进行了初步探索,结果表明:共生菌菌株0385D在50℃下处理60min和100℃10min.,其抑菌活性依旧很高;18W紫外线照射120min对共生菌0385D的抑菌活性的影响不明显。

昆虫病原线虫共生菌胞内外蛋白的提取及杀虫活性比较

通过超声波破碎、硫酸铵盐析等方法从10株昆虫病原线虫共生菌的发酵液中分离出各菌株的胞内和胞外蛋白,测定各蛋白样品含量及其对棉铃虫初孵幼虫的生长抑制毒性,并用Native-PAGE和SDS-PAGE对各粗蛋白组分进行初步分析。结果表明有7个菌株的胞内和胞外蛋白对棉铃虫初孵幼虫生长均显示出不同程度的抑制生长活性。其中以嗜线虫致病杆菌3个菌株CB6、All和Bw活性最强,其胞内蛋白的活性分别达97.1%、97.9%、97.2%,胞外蛋白分别达95.8%9、6.3%、88.6%。不同菌株胞内胞外蛋白产量各不相同。电泳图谱表明,不同菌株间及同一菌株胞内胞外蛋白有差异,但近缘菌株相似。

2株昆虫病原线虫共生菌代谢产物的抑菌作用

嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila YL001(简称YL001)和伯氏致病杆菌Xenorhabdusbovienii YL002(简称YL002)是分别从陕西杨凌土壤中筛选的2株昆虫病原线虫体内分离鉴定获得的共生菌。对这2株昆虫病原线虫共生菌发酵液及其无菌滤液的抑菌作用进行了研究。室内活性测定结果表明,2菌株对供试的14种植物病原真菌和5种病原细菌均有不同程度的抑制作用。其中,YL001发酵液对烟草赤星菌、番茄早疫菌、辣椒疫霉菌、南瓜枯萎菌、黄瓜炭疽菌和稻瘟菌,YL002发酵液对辣椒疫霉菌、黄瓜炭疽菌、稻瘟菌和小麦纹枯菌的抑制率均在75%-100%;无菌滤液仅对辣椒疫霉菌有较强的抑制作用,EC50分别为16.65和15.19 mL/L;YL001和YL002发酵液及其无菌滤液均对水稻白叶枯菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用,对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制作用较弱。盆栽试验结果表明,辣椒种子用YL001和YL002发酵液处理后,对辣椒疫霉病的防治效果分别为60.6%和73.2%;100 mL/L发酵液处理土壤后,对辣椒疫霉病的防治效果分别为48.72%和74.34%。