逆转录病毒载体介导的SynNotch门控系统构建

目的构建一种逆转录病毒载体介导的SynNotch门控系统。方法对逆转录病毒载体进行设计改造,在其两端插入绝缘子序列(insulator),并基于Gal4/UAS基因表达调控系统进行SynNotch门控系统的构建。首先采用逆转录病毒载体分别构建仅含有Gal4-VP64融合蛋白转录调控元件的门控质粒以及含有UAS激活序列的效应质粒,效应质粒使用绿色荧光蛋白(EGFP)及荧光素酶(luciferase)作为报告基因,共分为6种,其中三种为正向序列设计,将UAS序列以及报告基因正向插入逆转录病毒载体中(5’~3’),分别包括正向无绝缘子、正向单绝缘子、正向双绝缘子;另三种为反向序列设计,将UAS序列以及报告基因反向插入逆转录病毒载体中(3’~5’),分别包括反向无绝缘子、反向单绝缘子、反向双绝缘子。测序成功的质粒进一步通过病毒包装制备病毒载体,包括门控载体和效应载体。PCR法检测逆转录病毒滴度。将病毒载体转导入293T细胞,效应载体单独转导的293T细胞作为未诱导组,门控载体与效应载体共转导的293T细胞作为诱导组,分别通过流式细胞术及荧光素酶化学发光实验检测两组报告基因的表达效率。结果逆病毒载体滴度均在107~108拷贝/mL之间,且不低于阳性对照。流式细胞术的检测结果显示,正向设计的三种效应载体在未诱导的情况下EGFP的表达效率分别为95.5%、69.7%、76.2%,诱导后EGFP的表达效率分别为99.9%、95.3%、97.1%。反向设计的三种效应载体在未诱导的情况下EGFP的表达效率分别为0.085%、0.610%、7.400%,诱导后EGFP的表达效率分别为59.900%、77.900%、89.500%。荧光素酶化学发光实验的检测结果显示,正向设计的三种效应载体在未诱导的情况下luciferase表达的荧光强度均在104以上,诱导后荧光强度均在105以上;反向设计的三种效应载体在未诱导的情况下luciferase表达的荧光强度均在3×103以下,诱导后荧光强度均在104以上,诱导前后荧光强度比较,P<0.01,其中反向双绝缘子设计诱导后荧光强度可达到105以上。结论成功构建了一种逆转录病毒载体介导的SynNotch门控系统。

SynNotch系统在肿瘤治疗中的应用

SynNotch系统是在Notch信号通路基础上通过合成生物学方法设计出的一种工程化的受体系统。因其高度的灵活性和特异性,SynNotch系统在细胞治疗,组织工程,疾病模型等方面均有应用。肿瘤疾病的传统治疗方法中有相当大的局限性和副作用,而本文以SynNotch的结构和作用机制为出发点,总结了SynNotch在肿瘤治疗中的不同应用和机制,陈述SynNotch系统在癌症治疗领域的潜力,为后续的肿瘤治疗提供新的治疗策略。

Design and mathematical analysis of activating transcriptional amplifiers that enable modular temporal control in synthetic juxtacrine circuits

The ability to control mammalian cells such that they self-organize or enact therapeutic effects as desired has incredible implications.Not only would it further our understanding of native processes such as development and the immune response,but it would also have powerful applications in medical fields such as regenerative medicine and immunotherapy.This control is typically obtained by synthetic circuits that use synthetic receptors,but control remains incomplete.The synthetic juxtacrine receptors(SJRs)are widely used as they are fully modular and enable spatial control,but they have limited gene expression amplification and temporal control.As these are integral facets to cell control,I therefore designed transcription factor based amplifiers that amplify gene expression and enable unidirectional temporal control by prolonging duration of target gene expression.Using a validated in silico framework for SJR signaling,I combined these amplifiers with SJRs and show that these SJR amplifier circuits can direct spatiotemporal patterning and improve the quality of self-organization.I then show that these circuits can improve chimeric antigen receptor(CAR)T cell tumor killing against various heterogenous antigen expression tumors.These amplifiers are flexible tools that improve control over SJR based circuits with both basic and therapeutic applications.

利用邻近细胞遗传学技术揭示哺乳动物体内细胞间相互作用

细胞与细胞之间的交流和相互作用是多细胞生物的一项基本特征,解析细胞之间的相互作用对于深入了解多种生物学过程及其调控机制具有重要意义。但是目前领域内缺乏研究体内细胞互作的技术手段。该团队将人工合成Notch信号通路(synNotch)技术与传统遗传学手段相结合,建立了邻近细胞遗传学技术,用于监测细胞间相互作用并永久示踪接触过的细胞。通过构建表达synNotch通路的遗传工具小鼠,该团队在两种不同类型细胞中分别表达synNotch配体蛋白和受体蛋白,当相邻细胞配体和受体特异结合后,synNotch信号通路被激活从而开启下游报告基因原件的表达,实现遗传标记和永久示踪受体细胞。该团队利用邻近细胞遗传学技术揭示了心脏中心肌细胞和内皮细胞,以及肿瘤中肿瘤细胞和内皮细胞之间的动态相互作用。邻近细胞遗传学技术可以解决众多与细胞相互作用相关的重要科学问题,有助于开拓新的细胞互作研究方向。