花鲈Syntaxin 4基因及其在免疫应答反应中的表达特征

采用RT-PCR技术,从花鲈(Lateolabrax japonicus)中克隆得到膜蛋白Syntaxin 4基因近85%的CDS序列。同源性分析表明,该序列与斑马鱼以及哺乳动物的Syntaxin 4基因的有较高相似性。利用实时定量PCR技术分析Syntaxin 4基因在mRNA水平上的相对表达量。结果表明,该基因在脑组织和免疫相关组织中都有表达,以脑组织的表达量最多,在免疫相关组织中的表达量由多到少依次是脾脏、头肾和血液。在LPS刺激24 h后,脾脏和头肾中的表达量分别是对照组的7.83倍和10.41倍,表明免疫组织中Syntaxin 4基因的相对表达量随诱导增强,提示该基因在花鲈免疫应答反应中可能起重要作用。

Syntaxin4参与小鼠卵母细胞皮质颗粒的转运机制的研究

目的探讨Syntaxin4参与小鼠卵母细胞皮质反应及对皮质反应的影响。方法 RT-PCR和Western blot检测Syntaxin4在小鼠卵母细胞表达;免疫荧光验证Syntaxin4与皮质颗粒在卵母细胞中的定位,分析Syntaxin4对小鼠卵细胞皮质反应的影响;活细胞实时拍摄系统观察降低Syntaxin4表达后皮质反应的动态变化。结果 (1)Syntaxin4在小鼠卵母细胞中表达,且在GV期和MII期无明显变化;(2)Syntaxin4与小鼠卵细胞皮质颗粒共定位;(3)活细胞实时拍摄证实降低Syntaxin4的表达后阻碍了皮质反应的进行。结论 Syntaxin4参与小鼠卵细胞皮质反应。

突触融合蛋白结合蛋白4对口腔鳞状细胞癌细胞增殖和迁移的影响

目的:观察突触融合蛋白结合蛋白4(STXBP4)在口腔鳞状细胞癌(OSCC)中的表达情况及其对OSCC细胞恶性生物学行为的影响。方法:(1)通过TIMER、GEPIA2、UALCAN、ENCORI、GEO和HPA数据库从mRNA和蛋白水平综合研究STXBP4在头颈鳞状细胞癌组织中的表达情况。采用qPCR和Western blot分别检测OSCC细胞系中STXBP4的mRNA和蛋白表达水平。(2)用RNA干扰技术下调SCC-9细胞中STXBP4表达,构建敲减组(si-STXBP4-1、si-STXBP4-2和si-STXBP4-3组)和阴性对照组(si-NC组);通过慢病毒转染技术过表达CAL-27细胞中的STXBP4,构建过表达组(LV-STXBP4组)和阴性对照组(LV-NC组)。分别用CCK-8实验、平板集落形成实验和Transwell实验检测OSCC细胞活力、集落形成能力和迁移能力;用Western blot检测上皮-间充质转化(EMT)相关蛋白表达。(3)用裸鼠皮下移植瘤模型探究STXBP4在体内对OSCC细胞增殖的影响。结果:(1)TIMER、GEPIA2、UALCAN、ENCORI和GEO数据库分析发现,与正常组织相比,STXBP4的mRNA水平在头颈鳞状细胞癌组织中表达上调;HPA蛋白数据库分析显示,STXBP4在头颈鳞癌组织中表达比正常口腔黏膜组织较高。与正常口腔黏膜细胞相比,STXBP4在5种OSCC细胞系中高表达(P<0.05)。(2)SCC-9细胞转染si-STXBP4-1、si-STXBP4-2和si-STXBP4-3后,STXBP4的表达显著低于si-NC组(P<0.01);相较于si-NC组,敲减STXBP4的表达后,SCC-9细胞的增殖能力和迁移能力显著降低(P<0.05)。过表达STXBP4后的CAL-27细胞中,STXBP4的表达量显著高于LV-NC组(P<0.01);LV-STXBP4组中CAL-27细胞的增殖能力和迁移能力显著高于LV-NC组(P<0.01)。敲减STXBP4表达后Ncadherin的蛋白表达水平显著降低,而E-cadherin的蛋白表达水平则升高,过表达STXBP4后结果相反(P<0.05)。(3)与LV-NC组相比,过表达STXBP4后,裸鼠皮下移植瘤体积和重量显著升高(P<0.05)。结论:STXBP4在OSCC中高表达,可促进OSCC细胞的增殖和迁移,其对OSCC细胞迁移行为的影响可能与EMT有关。

突触融合蛋白4在不同毛色小鼠皮肤组织的差异表达

旨在探讨突触融合蛋白4(Syntaxin4,STX4)在皮肤组织细胞中的表达与定位,确定其是否与毛色形成存在相关性。选择白、灰、黑3种毛色皮肤组织样品(6只昆明小鼠白毛色背部皮肤、6只C57BL/6小鼠灰毛色腹部皮肤和黑毛色背部皮肤)和体外培养小鼠黑色素细胞样品,通过PCR扩增、Real-time PCR、免疫组化和Western blot技术对STX4的表达情况进行定性和定量分析。结果表明:在3种毛色皮肤样品和黑色素细胞样品中均扩增出897bp CDS区序列片段;Real-time PCR检测显示,STX4在白灰黑3种毛色皮肤样品中均有表达,黑色皮肤表达量最高,灰色皮肤表达量次之,分别是白色皮肤的3.44倍和1.92倍;免疫组化结果表明,在白色和黑色皮肤表达于整个毛囊,包括角化细胞;在体外培养黑色素细胞也显示阳性表达;Western blot结果显示,在白、灰、黑色皮肤和黑色素细胞样品中均有STX4阳性条带,表达量与荧光定量结果一致。综上表明,STX4在小鼠皮肤组织、毛囊角化细胞、黑色素细胞有效表达,且表达量在白灰黑皮肤中呈递增趋势,推测STX4与小鼠毛色形成呈正相关性。

脂肪细胞中Munc18c的缺失不影响胰岛素诱导的GLUT4转运

动物脂肪和肌肉组织中葡萄糖的摄取是通过受胰岛素调控的GLUT4储存囊泡的运输实现的.Sec1p的同源物Munc18c被认为是通过控制SNARE复合物的装配来使GLUT4囊泡锚定到质膜上的重要物质.我们发现Munc18c的缺失没有影响GLUT4的转运上膜,也没有影响Syntaxin4在细胞膜上的定位.在缺少Munc18c和功能性Syntaxin2的时候,GLUT4的转运可能和Munc18b有关.在3T3-L1脂肪细胞中与Syntaxin4具有强烈相互作用的是Munc18c而不是Munc18a和Munc18b.然而,当缺少Munc18c时,Munc18a和Munc18b与Syntaxin4体现出较弱的相互作用.因此,Syntaxin4可能在胰岛素刺激GLUT4转运过程中起到重要的作用,且与SM蛋白的相互作用是有代偿性的.

Syntaxin4蛋白在NK细胞中的表达及与SNAP-23蛋白的相互作用

目的 研究NK细胞中与囊泡分泌有关的膜蛋白syntaxin 4的表达和与其它蛋白的相互作用 ,为进一步研究NK细胞免疫效应的分泌调节分子机制提供新思路。方法 RT PCR和免疫印迹方法检测人类NK细胞syntaxin 4的表达 ,免疫荧光显微镜观察静息状态和经靶细胞激活后syntaxin4蛋白在NK92细胞中表达和分布的变化 ,免疫共沉淀检测syntaxin 4蛋白和SNAP 2 3蛋白的相互作用。结果 人类NK细胞中在mRNA水平和蛋白质水平均有syntaxin 4组成性表达 ,蛋白产物主要分布在细胞膜上。异种靶细胞刺激后 ,syntaxin 4蛋白有明显的细胞内定位变化和极化现象。syntaxin 4蛋白和SNAP 2 3蛋白有较强的相互作用。结论 syntaxin 4蛋白与NK细胞对靶细胞的识别过程有关 ,并与胞内膜交换相关分子SNAP 2 3蛋白相互作用 ,可作为研究干预移植排斥反应中杀伤性胞吐的新目标分子。

重组人突触融合蛋白4对脂多糖诱导的胰岛β细胞INS-1损伤影响和机制研究

目的:探讨重组人突触融合蛋白4(STX4)对脂多糖(LPS)诱导的胰岛β细胞INS-1损伤影响。方法:胰岛β细胞INS-1分成Control组(空白对照)、LPS组(LPS处理)、LPS+NC组(转染阴性对照载体,LPS处理)、LPS+STX4组(转染pcDNA-STX4,LPS处理),RT-qPCR和Western blot检测STX4 mRNA和蛋白质表达,流式细胞术检测凋亡,DCFHDA法检测活性氧簇(ROS)水平、黄嘌呤氧化法检测超氧化物歧化酶(SOD)水平、比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平、钼酸铵比色法检测过氧化氢酶(CAT)水平、硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)水平,ELISA法检测细胞分泌的白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平和葡萄糖条件下胰岛素分泌水平,Western blot法检测Cleaved Caspase-3、Bax、p65蛋白质表达。用NF-κB信号通路激活剂处理上调STX4后的胰岛β细胞INS-1,给予LPS刺激,同样利用上述方法测定细胞凋亡、ROS、SOD、GSH-Px、CAT、MDA水平和分泌的IL-1β、TNF-α、胰岛素水平以及Cleaved Caspase-3、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、p65蛋白质水平。结果:与Control组比,LPS组胰岛β细胞中STX4 mRNA和蛋白质表达均减少,细胞凋亡率、ROS水平、MDA水平均升高,SOD、GSH-Px、CAT水平均降低,细胞分泌的IL-1β、TNF-α水平均升高,细胞分泌的胰岛素水平降低,Cleaved Caspase-3、Bax、p65蛋白质表达水平也升高。NF-κB信号通路激活剂处理逆转上调STX4对LPS条件下胰岛β细胞凋亡、ROS、SOD、GSH-Px、CAT、MDA水平和分泌的IL-1β、TNF-α、胰岛素水平以及Cleaved Caspase-3、Bax、p65蛋白质水平影响。结论:上调STX4抑制LPS诱导的胰岛β细胞氧化损伤、细胞凋亡和炎症因子释放,机制与降低NF-κB信号通路激活水平有关。