NFATc4在舌鳞状细胞癌神经侵犯诊断中的作用

目的:通过比较活化T细胞核因子胞质4(NFATc4)与S100钙结合蛋白(S100)、p75神经营养素受体(p75)对舌鳞状细胞癌(TSCC)神经侵犯(PNI)的免疫组织化学染色特点,探索NFATc4在TSCC PNI诊断中的作用。方法:收集59例TSCC病理标本,10例癌前病变为对照组,每个标本连续切片后采用免疫组织化学染色,观察NFATc4对TSCC以及神经的染色情况,并与S100和p75进行比较。结果:59例TSCC病理标本中,NFATc4阳性率为47.5%(28/59),PNI发生率为35.6%(21/59),NFATc4阳性表达组的PNI发生率高于NFATc4阴性表达组(P<0.05),NFATc4染色可见神经内膜淡染色,TSCC细胞胞质可见染色,NFATc4对神经的鉴别效果与S100和p75比较,无统计学差异(P>0.05)。结论:NFATc4的表达与PNI的发生存在关联,NFATc4能在染色神经束的同时,将TSCC组织染色,可以在同一个视野内直观地观察肿瘤与神经的关系,有利于提高PNI判读准确率,有望成为一个判断PNI的指标。

芒果苷对心肌细胞损伤的保护作用及对NFATc4表达的影响

目的研究芒果苷对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的心肌细胞氧化应激损伤的保护作用,以及对活化T细胞核因子c4(NFATc4)表达的影响。方法体外培养心肌H9c2细胞,分为空白组、H_(2)O_(2)组和芒果苷50、100、150μmol/L组,芒果苷组细胞在经不同浓度芒果苷作用12 h后,再与H_(2)O_(2)组一同经H_(2)O_(2)(200μmol/L)刺激12 h,检测各组细胞的相对存活率,细胞上清液中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)水平,细胞中活性氧(ROS)水平,以及细胞中凋亡相关蛋白[B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、剪切的胱天蛋白酶3(cleaved caspase-3)]、核蛋白NFATc4的表达情况。转染NFATc4干扰序列,考察NFATc4对H_(2)O_(2)诱导的心肌细胞中氧化应激指标和凋亡相关蛋白的影响。结果与空白组比较,H_(2)O_(2)组细胞的相对存活率,SOD、CAT水平,Bcl-2的相对表达量均显著降低;MDA、ROS水平,Bax、cleaved caspase-3和核蛋白NFATc4的相对表达量均显著升高(P<0.05或P<0.01)。与H_(2)O_(2)组比较,芒果苷100、150μmol/L组细胞的上述指标均得以显著逆转(P<0.05)。转染NFATc4干扰序列后,核蛋白NFATc4的表达显著下调,MDA、ROS水平和Bax、cleaved caspase-3蛋白的表达均较H_(2)O_(2)组显著降低/下调,SOD、CAT水平和Bcl-2蛋白的表达均较H_(2)O_(2)组显著升高/上调(P<0.05)。结论芒果苷能够减轻H_(2)O_(2)诱导的H9c2细胞氧化应激,减少细胞凋亡,抑制NFATc4蛋白入核,进而缓解心肌细胞损伤;降低NFATc4蛋白的核内水平与减轻H_(2)O_(2)诱导的氧化应激、细胞凋亡有关。

食管癌来源外泌体通过E2F4对CD4+T细胞向Th17细胞分化的影响

目的:研究食管癌来源外泌体对CD4+T细胞向Th17细胞分化的可能作用机制。方法:分离人正常食管上皮细胞HEEC和人食管癌细胞Eca-109来源外泌体(即HEEC-Exo、Eca-109-Exo),同时构建稳定表达的sh-NC和sh-E2F4的Eca-109细胞株并分离其外泌体(即sh-NC-Exo、sh-E2F4-Exo)。应用所得的外泌体处理CD4+T细胞;此外,应用稳定表达sh-NC和sh-E2F4的Eca-109细胞株建立食管癌异种移植小鼠模型。流式细胞术检测CD4+T细胞中Th17细胞比例;qRT-PCR检测E2F转录因子4(E2F4)mRNA表达;Western blot检测E2F4、维甲酸相关核孤儿受体γt(ROR-γt)和IL-17蛋白表达;ELISA试剂盒检测IL-17的含量。结果:与PBS组相比,HEEC-Exo组CD4+T细胞中Th17细胞比例、ROR-γt蛋白的表达、IL-17含量以及E2F4mRNA和蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);与HEEC-Exo组相比,Eca-109-Exo组CD4+T细胞中Th17细胞比例、ROR-γt蛋白表达、IL-17含量以及E2F4 mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05)。与Eca-109-Exo组相比,sh-NC-Exo组CD4+T细胞中Th17细胞比例、ROR-γt蛋白表达、IL-17含量以及E2F4 mRNA和蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);与sh-NC-Exo组相比,shE2F4-Exo组CD4+T细胞中Th17细胞比例、ROR-γt蛋白表达、IL-17含量以及E2F4 mRNA和蛋白表达均明显降低(P<0.05)。与Eca-109组相比,sh-NC组小鼠肿瘤大小和E2F4、ROR-γt、IL-17蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);与sh-NC组相比,sh-E2F4组小鼠肿瘤大小和E2F4、ROR-γt、IL-17蛋白表达均明显降低(P<0.05)。结论:食管癌来源外泌体可能通过E2F4促进CD4+T细胞向Th17细胞分化,从而促进肿瘤生长。

Axin过表达下调β-catenin和TCF-4表达并抑制肺癌BE1细胞的增殖和侵袭

背景与目的Axin是Wnt通路的重要负性调节因子,其低表达和β-catenin、TCF-4的高表达与多种肿瘤有关。本研究旨在探讨axin在肺癌细胞中的表达与β-catenin和TCF-4的关系,及其对肺癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。方法将axin基因转染入axin低表达的肺癌BE1细胞系,应用免疫荧光方法观察转染组和对照组细胞中axin的表达对β-catenin和TCF-4的影响;采用RT-PCR方法检测axin和β-catenin、TCF-4mRNA表达的变化;采用流式细胞术、MTT和Transwell检测肺癌细胞凋亡、增殖和侵袭能力的变化。结果肺癌BE1细胞转染axin基因后(BE1-axin),axin的mRNA和蛋白水平均明显增加,β-catenin蛋白表达明显减少,TCF-4的蛋白和mRNA表达均明显下降。同时,BE1-axin细胞的凋亡率增加,增殖和侵袭能力明显下降。结论Axin过表达能下调β-catenin的蛋白表达和TCF-4的转录,抑制肺癌细胞的增殖和侵袭能力,并诱导肺癌细胞凋亡。

β-连环素与T细胞因子4在非小细胞肺癌中表达关系及意义

背景与目的β-连环素(β-catenin)和T细胞因子4(TCF-4)表达与非小细胞肺癌(NSCLC)临床病理因素相关,本研究的目的是分析NSCLC中β-连环素与TCF-4的关系和意义。方法应用免疫组化方法观察NSCLC中β-连环素表达情况;应用免疫荧光、免疫共沉淀、原位杂交等方法分析NSCLC中β-连环素异常定位、蓄积及与TCF-4的关系。结果NSCLC中β-catenin的蛋白和mRNA水平明显高于癌旁正常肺组织,β-连环素在NSCLC肿瘤细胞胞浆和(或)胞核异常表达率为78.74%(100/127),其中核表达率为37.01%(47/127)。β-连环素异常表达与分化程度(P=0.0008)和淋巴结转移(P=0.017)相关。TCF-4在86.67%(52/60)的肿瘤细胞核和(或)浆表达,中、低分化肺癌组织的TCF-4表达强度显著高于高分化癌组织。免疫共沉淀检测发现β-连环素和TCF-4核内共同表达的病例中有76.47%(13/17)存在β-连环素/TCF-4复合体,其中核内61.54%,浆内38.46%。结论β-连环素蛋白和 mRNA的异常表达与NSCLC的恶性表型有关。TCF-4的表达与肺癌的低分化程度相关,β-连环素/TCF-4复合体在NSCLC中较普遍存在。

MAD2B与TCF4相互作用及其对毛乳头细胞功能的影响

目的探讨MAD2B基因过表达对毛乳头细胞(dermal papilla cells,DPCs)生物学功能的影响。方法构建真核表达载体pIRES2-MAD2B和pIRES2-TCF4质粒,在LipofectamineTM2000脂质体的介导下转染毛乳头细胞,荧光显微镜下观察转染效率,使用Western blot检测目的蛋白的表达,并验证两种蛋白的相互作用,比较细胞增殖状况,Wnt通路信号强度,毛乳头分泌胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth-promoting factors,HGF)的变化情况。结果成功构建pIRES2-MAD2B和pIRES2-TCF4重组质粒,且转染后发现MAD2B和TCF4蛋白过表达于毛乳头细胞。免疫共沉淀实验结果提示在凝集生长的毛乳头细胞中存在相互作用的MAD2B和TCF4蛋白质复合物。在MAD2B过表达于毛乳头细胞之后,发现Wnt途径信号通路强度下调。CCK-8实验结果提示MAD2B过表达后细胞增殖活性下降,与对照组比较有统计学差异(P<0.05);同时实时荧光定量PCR检测结果显示,与对照组相比,IGF-1、VEGF、HGF mRNA的表达有所下降(P<0.05)。结论免疫共沉淀提示MAD2B与TCF4在毛乳头细胞中存在相互作用,MAD2B过表达后可能通过抑制Wnt信号通路而对毛乳头细胞增殖和其旁分泌因子IGF-1、VEGF、HGF产生抑制作用。

T细胞转录因子-4在大鼠脑缺血再灌注海马齿状回神经干细胞中的表达

目的:检测T细胞转录因子-4(Tcf-4)在大鼠脑缺血再灌注海马组织神经干细胞中的表达及其变化。探讨影响神经干细胞早期增殖分化的分子调控机制。方法:采用大脑中动脉栓塞(MCAO)制作大鼠脑缺血再灌注模型。用免疫组织化学SP法及RT-PCR法检测海马神经干细胞BrdU、Tcf-4中的表达。结果:随着脑缺血再灌注第3日齿状回神经元BrdU阳性细胞明显增多,第7日达高峰,然后逐渐减少。Tcf-4 mRNA反应产物随脑缺血再灌注时间延长逐渐增多,第21日表达最强,以后表达逐渐减少。结论:Tcf-4时间依赖性表达与神经干细胞增殖分化进程相吻合,说明其在神经干细胞晚期分化中起重要调控作用。

β-连环素/TCF-4复合体在非小细胞肺癌的研究

目的该研究通过观察β-连环素/TCF-4复合体在NSCLC的表达及β-连环素/TCF-4复合体与NSCLC病理分型、细胞分化的关系,探寻经典Wnt信号通路参与(NSCLC)的直接证据。方法利用双标记免疫荧光法及免疫沉淀和Western boltting检测β-连环素/TCF-4复合体在NSCLC的表达。结果在35%的NSCLC组织中存在β-连环素/TCF-4复合体且主要表达于细胞核,而正常癌旁组织无但β-连环素/TCF-4复合体表达;β-连环素/TCF-4复合体表达与NSCLC的病理分型、细胞分化无显著相关性。结论经典的Wnt信号通路可能通过β-连环素/TCF-4复合体参与部分NSCLC的病变过程。

T细胞因子3基因沉默对小鼠睾丸胚胎癌细胞Oct4表达的影响

目的:探讨T细胞因子3(TCF3)基因沉默对小鼠睾丸胚胎癌F9细胞干性基因Oct4表达的影响,阐明TCF3对F9细胞中Oct4表达调控的作用机制。方法:采用RNAi技术将TCF3基因沉默作为TCF3干涉组,同时设立空白对照组和阴性对照组。采用RT-PCR和Western blotting方法观察各组细胞TCF3和Oct4mRNA和蛋白表达水平,细胞免疫荧光法观察F9细胞中Oct4的表达。结果:Oct4在F9细胞核中高度表达。与空白对照和阴性对照组比较,TCF3干涉组TCF3mRNA和蛋白表达水平显著下调,差异有统计学意义(P<0.01);Oct4mRNA和蛋白表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);而空白对照组与阴性对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:TCF3基因干涉可以促进F9细胞中Oct4的转录和蛋白表达,提示TCF3可以负向调控F9细胞中Oct4的表达,是Oct4的抑制因子之一。

参地颗粒对系膜增生性肾小球肾炎大鼠CTLA-4/B7-1介导的免疫炎症紊乱的干预作用

目的:建立系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)大鼠模型,观察参地颗粒对MsPGN大鼠细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)/B7-1介导的免疫炎症紊乱的干预作用。方法:将60只SD大鼠随机选取10只作为正常组,余下50只建立MsPGN大鼠模型,死亡11只,剔除不合格3只,共36只大鼠成功建立MsPGN模型,随机分为模型组、参地颗粒组和缬沙坦组,每组12只。参地颗粒组给予0. 4 g/(100 g·d)灌胃,缬沙坦组给予1. 03 mg/(100 g·d)灌胃,正常组和模型组给予等量温水灌胃。12周后观察各组大鼠24 h尿蛋白定量和肾脏组织病理学改变,采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测大鼠血清白介素-2(IL-2)、IL-6、干扰素-γ(IFN-γ)、CTLA-4、B7-1水平。结果:模型组大鼠24 h尿蛋白定量高于正常组(P<0. 05),治疗后参地颗粒组和缬沙坦组均低于模型组(P<0. 05),且参地颗粒组优于缬沙坦组(P<0. 05);模型组肾组织病理示肾小球系膜细胞与系膜基质增生,治疗后参地颗粒组和缬沙坦组均较模型组轻,参地颗粒组优于缬沙坦组(P<0. 05);模型组大鼠血清IL-6、IFN-γ、B7-1水平均高于正常组(P<0. 05),IL-2、CTLA-4水平均低于正常组(P<0. 05),治疗后参地颗粒组和缬沙坦组IL-6、IFN-γ、B7-1水平均低于模型组(P<0. 05),IL-2、CTLA-4水平均高于模型组(P<0. 05),且参地颗粒组优于缬沙坦组(P<0. 05)。结论:参地颗粒可以降低MsPGN大鼠尿蛋白定量,减轻肾脏病理损害,其机理可能与抑制CTLA-4/B7-1介导的免疫炎症反应有关。

阿托伐他汀对人CD4＋T淋巴细胞程序性细胞死亡因子4基因表达的影响

目的:研究阿托伐他汀在体外对人CD4+T淋巴细胞程序性细胞死亡因子4(PDCD4)表达的影响。方法:取20例健康志愿者的新鲜外周血,随机分为空白组、PHA刺激组、PHA+(1、5、10μmol/L)阿托伐他汀组,体外培养48 h后进行PDCD4 mRNA和蛋白及相关炎性因子的检测。结果:PHA刺激组PDCD4mRNA、蛋白表达及上清TNF-α及IL-10浓度均升高(均P<0.05);经阿托伐他汀干预后,能够使PDCD4mRNA、蛋白表达量及TNF-α浓度明显下降,而上清液IL-10浓度进一步增加;TNF-α与PDCD4蛋白呈明显的正相关(r=0.782,P<0.01),IL-10与PDCD4蛋白呈明显的负相关(r=-0.653,P<0.05)。结论:阿托伐他汀能够通过调控人CD4+T淋巴细胞PDCD4表达,从而发挥抗炎的作用。

调控大肠癌形成的分子开关——T细胞因子-4

目的探讨T细胞因子-4(T cell factor-4,TCF-4)在调控大肠癌形成中的作用。方法收集近年来国内、外有关研究TCF-4与结直肠癌形成机理的文献并作一综述。结果对于TCF-4基因,不同的剪接形式产生不同的异构体,编码不同的蛋白质。TCF-4蛋白为序列特异的DNA结合蛋白,不能独立激活或抑制转录,需通过其多个结构域与不同的配体发生相互作用,从而产生不同的效应。结论TCF-4被视为将其他辅助蛋白质靶定于一组确切启动子的核传播媒介,在调控大肠癌的形成中起着分子开关的作用。

严重腹腔感染时小肠隐窝中Tcf-4表达的变化及意义

目的探讨大鼠严重腹腔感染时T细胞因子4（Tcf-4）表达的变化规律及意义。方法健康成年Wistar大鼠40只被随机分为对照组（仅行单纯剖腹手术）和腹腔感染[采用盲肠结扎穿孔术（CLP）制备严重腹腔感染模型]后12、24和48h组，每组10只。应用免疫组化及逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测各组大鼠小肠隐窝Tcf-4阳性细胞及Tcf-4 mRNA表达的改变。结果免疫组化结果表明，对照组大鼠肠黏膜隐窝底部细胞中Tcf-4仅有微弱表达，而CLP后12h肠黏膜隐窝底部细胞中Tcf-4阳性细胞数明显增多，24h达峰值，至48h仍显著高于对照组（P均〈0．01）。RT—PCR结果表明，与对照组（0．19±0．01）比较，CLP后12h Tcf-4 mRNA明显上升（0．21±0．01，P〈0．01），至24h达峰值（0．28±0．02，P〈0．01），随后逐渐下降，到48h（0．20±0．01）仍显著高于对照组（P〈0．05）。结论严重腹腔感染早期可诱导Tcf-4表达，提示Tcf-4可能与肠卜皮干细胞的增殖分化密切相关。

髓核细胞中活化T细胞核因子对ADAMTS-4启动子的调控作用

目的观察活化T细胞核因子(NFAT)-1、4、5在髓核细胞中对聚蛋白聚糖酶ADAMTS-4启动子活性的影响,初步探讨椎间盘退变可能的分子机制。方法将ADAMTS-4-pβ-gal-Basic质粒经限制性内切酶XhoⅠ及HindⅢ酶切后插入到PGL3-Basic质粒中,经筛选后获得纯化的PGL3-ADAMTS-4质粒。离体培养后,使用Lipofectamine 2000系统进行转染实验,将NFAT-1、NFAT-4、NFAT-5以及DN-TonEBP质粒和PGL3-ADAMTS-4质粒共转染大鼠髓核细胞。将正常髓核细胞和转染后的髓核细胞分别作为对照组和实验组。用双荧光素酶报告基因检测系统测髓核细胞中NFAT-1、NFAT-4、NFAT-5对ADAMTS-4基因启动子活性的影响。结果构建了ADAMTS-4基因双荧光素酶报告质粒,发现2个NFAT结合元件。与对照组相比,转染NFAT-1的髓核细胞中ADAMTS-4启动活性被抑制(P<0.05),而转染NFAT-4、NAFT-5以及DN-TonEBP的髓核中ADAMTS-4启动子活性改变无统计学意义(P>0.05)。结论 NFAT-1可调控ADAMTS-4的表达,可能在椎间盘生理以及退变过程中对蛋白聚糖的含量起重要调控作用,为椎间盘退变的生物学治疗提供了一个新的策略。

T-bet、GATA-3、FoxP3及CD_4^+CD_(25)^+调节性T细胞在AA发病机制中的作用

目的探讨转录因子T-bet、GATA-3和CD+4CD+25调节性T细胞及其转录因子FoxP3在再生障碍性贫血(AA)发病机制中的作用。方法选择AA患者27例(AA组)、体检健康者25例(对照组),采用RT-PCR技术检测两组外周血单个核细胞(PBMCs)中Th1、Th2细胞及CD4+CD2+5调节性T细胞特异性转录因子T-bet、GATA-3、FoxP3 mR-NA的表达,运用流式细胞术检测外周血中T淋巴细胞亚群,ELISA法检测血浆中Th1和Th2类细胞因子IFN-γ、IL-4水平。结果与对照组相比,AA组的血浆T-bet mRNA相对表达量升高(P<0.01),GATA-3与FoxP3 mRNA相对表达量降低(P<0.05,P<0.01);AA组外周血中CD+3、CD+3CD+8T细胞占淋巴细胞的百分比较对照组升高(P均<0.05),CD+3CD+4、CD+4CD+25T细胞占淋巴细胞的百分比和CD+4/CD+8值较对照组降低(P<0.05或P<0.01);AA组血浆中IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4高于对照组(P均<0.01)。结论 AA患者存在CD+4CD+25调节性T细胞及其特异性转录因子FoxP3 mRNA表达下调,调节性T细胞的减少及由此引起免疫抑制效应不足可能是AA发生的重要原因之一。

组织T细胞因子4、P糖蛋白和抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-xl在结直肠癌中的表达及其临床意义

目的探讨组织T细胞因子4（TCF－4）、P糖蛋白（P—gP）和抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤－x1（Bcl—x1）在结直肠癌中的表达及其临床病理特征的关系。方法选取广州医科大学附属广州市第一人民医院2013年1～12月100例手术切除结直肠癌组织及距病灶10em以上的正常组织。应用免疫组化的方法，分别检测TCF－4、P—gP和Bcl—x1蛋白在结直肠癌组织及正常组织的表达，并分析其与临床病理的关系。结果TCF－4、P—gP和Bcl—x1在结直肠癌组织中的阳性表达率分别为85％、67％和84％。明显高于正常黏膜组织（9％、2％、7％），差异有统计学意义（P〈0．05）；结直肠癌组织中TCF-4、P—gP，Bcl-x1三者间表达呈正相关（r=0．301、0．581、0．390，P〈0．01）。结直肠癌组织中TCF－4和Bcl—x1阳性表达与肿瘤组织的分化程度呈正相关（r=0．390，P〈0．01），结直肠癌组织中TCF－4、P—gP，Bcl—x1阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、组织学类型之间无明显相关（P〉o．05），与浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期有关（P〈0．05）。结论结直肠癌组织中TCF-4、P—gP和Bcl—x1的表达与浸润、转移、TNM分期及复发密切相关，可作为判断结直肠癌患者预后的指标，P—gP和Bcl—xl在结直肠癌中的多药耐药机制可能与Wnt／β-Catenin—TCF信号通路TCF－4有关。

miR-338-3p/TCF4对脉络膜微血管内皮细胞增生及凋亡的影响

目的探讨微小RNA-338-3p(miR-338-3p)对脉络膜微血管内皮细胞增生和凋亡的影响及其调控机制。方法体外培养人脉络膜微血管内皮细胞,将培养的细胞分为血管内皮生长因子(VEGF)组和正常对照组,正常对照组细胞常规培养,VEGF组细胞应用VEGF处理24 h;将VEGF组培养的细胞分为4个亚组,分别将阴性对照(miR-NC)、miR-338-3p拟似物、miR-338-3p拟似物+pcDNA、miR-338-3p拟似物+pcDNA-TCF4转染至脉络膜微血管内皮细胞后用VEGF处理24 h。采用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测细胞中miR-338-3p和TCF4相对表达量;采用MTT法检测细胞增生率以评估细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡率;行双荧光素酶报告实验验证miR-338-3p与TCF4的靶向关系;采用Western blot法检测细胞中增生标记蛋白细胞增生核抗原-67(Ki-67)、增生细胞核抗原(PCNA)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(bax)、B淋巴细胞瘤-2(bcl-2)蛋白相对表达量。结果与正常对照组比较,VEGF组细胞中miR-338-3p mRNA表达水平显著降低,TCF4 mRNA表达水平显著升高,细胞增生率显著升高,细胞凋亡率显著降低,细胞中Ki-67、PCNA、bcl-2蛋白表达水平显著升高,bax蛋白水平显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);与VEGF+miR-NC组比较,VEGF+miR-338-3p组细胞增生率显著降低,细胞凋亡率显著升高,细胞中Ki-67、PCNA、bcl-2蛋白表达水平显著降低,bax蛋白表达水平显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05);双荧光素酶报告实验证实miR-338-3p可靶向结合TCF4;与VEGF+miR-338-3p+pcDNA组比较,VEGF+miR-338-3p+pcDNA-TCF4组细胞增生率显著升高[(56.48±13.20)%vs.(96.24±16.24)%],细胞凋亡率显著降低[(30.59±3.57)%vs.(12.36±1.29)%],细胞中Ki-67、PCNA、bcl-2蛋白表达水平显著升高(0.41±0.11 vs.0.96±0.19;0.44±0.10 vs.0.97±0.20;0.55±0.12 vs.0.98±0.15),bax蛋白表达水平显著降低(0.87±0.13 vs.0.42±0.11),差异均有统计学意义(t=5.700、14.408、7.516、7.111、6.715、7.927,均P<0.01)。结论miR-338-3p过表达可负向调控TCF4在细胞中的表达量,从而抑制脉络膜微血管内皮细胞的增生及诱导细胞凋亡。

miR-129通过抑制T细胞因子4的表达影响肺癌A549细胞的上皮间质转化

目的:探讨miR-129对肺腺癌细胞系A549中T细胞因子4(TCF4)的表达及上皮间质转化(EMT)进程的影响及其机制。方法:将miR-129寡核苷酸片段miR-129 mimic转染A549细胞,实时定量PCR验证转染效率。实时定量PCR和蛋白质印迹实验检测转染后A549细胞TCF4、E-钙黏蛋白和波形蛋白的mRNA和蛋白表达水平。设计合成miR-129 mimic,将其与TCF4 3’-UTR报告基因质粒共转染HEK-293细胞,检测miR-129对TCF4报告基因质粒荧光素酶活性的影响,证实TCF4是miR-129的靶基因。结果:实时定量PCR及蛋白质印迹结果均表明,上调miR-129表达后,A549细胞TCF4、波形蛋白表达明显下调(P <0. 05或P <0. 01),E-钙黏蛋白表达明显上调(P <0. 01)。miR-129明显抑制TCF4报告基因质粒荧光素酶活性(P <0. 01)。结论:miR-129通过抑制TCF4的表达阻遏A549细胞的EMT进程。

清热化湿方通过上调miRNA-155 抑制Wnt/β-catenin信号通路治疗胃癌的作用机制研究

目的研究清热化湿方干预miRNA-155抑制Wnt/β-catenin信号通路治疗胃癌的作用机制。方法将30只裸鼠随机分为模型组、对照组(0.004g/kg顺铂+0.02g/kg氟尿嘧啶)、过表达组和清热化湿方低、中、高剂量组(2.71、5.43、10.86g/kg),每组5只。过表达组接种过表达miRNA-155AGS细胞,其余各组均接种AGS细胞,以复制胃癌荷瘤模型。对照组腹腔注射相应药物,其余各组灌胃相应药物或生理盐水,每天1次,连续3周。测定各组裸鼠的肿瘤组织质量,观察肿瘤组织的病理学形态,检测肿瘤组织中miRNA-155以及Wnt7、β-catenin、T细胞因子4(TCF-4)蛋白和mRNA表达水平。结果与模型组比较,对照组、过表达组及清热化湿方高剂量组裸鼠肿瘤组织质量均显著降低(P<0.05);Wnt7、β-catenin、TCF-4mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05),miRNA-155表达水平均显著升高(P<0.05);肿瘤细胞均出现不同程度的排列疏松,核染色较浅,出现坏死灶。结论清热化湿方可通过上调miRNA-155,抑制Wnt/β-catenin信号通路中Wnt7、β-catenin、TCF-4mRNA和蛋白的表达,进而抑制胃癌荷瘤模型裸鼠的瘤体生长。

GIP/GIPR经Akt-TCF4-GIPR正反馈增强GIP效应

旨在从GIP/GIPR下游的Akt和PKA信号通路中筛选出调控GIPR表达的调控因子,并解析GIPR的表达调控机制。本研究以小鼠胰岛瘤细胞系Min6为试验材料,在Akt、PKA信号通路阻断的条件下,通过Western blot筛选出与GIPR表达相关的转录因子T细胞因子4(TCF4);利用双荧光素酶报告系统确定TCF4对GIPR表达调控的影响,再通过敲除或过表达TCF4进一步验证两者之间的调控关系;采用CCK8法检测TCF4介导的促增殖作用,ELISA检测胰岛素分泌能力。结果显示,GIP可激活Akt磷酸化,并促进GIPR表达;在GIP激活及Akt、PKA信号通路阻断时,GIPR蛋白表达趋势与TCF4始终一致;TCF4可与GIPR核心启动子区结合,进而调控其表达;TCF4过表达时,GIPR的mRNA和蛋白表达上调,并促进β细胞增殖及胰岛素分泌;干扰TCF4显著降低GIP作用下GIPR的mRNA和蛋白表达,抑制β细胞增殖。综上,GIP结合GIPR后,经Akt信号通路上调TCF4进而增强GIPR表达,形成正反馈加强GIP信号,提高β细胞增殖和胰岛素分泌的功能,维持血糖稳态。因此,在胰岛素抵抗阻断Akt及上游信号通路时,经转录因子TCF4增强GIPR表达可作为改善胰岛β细胞功能障碍的靶点。