重组免疫融合肽Tα1-BP5的表达及其免疫佐剂特性研究

胸腺素α1(Tα1)和法氏囊活性五肽(BP5)均具有重要的免疫学功能,但二者在蛋白水平上的联合应用尚未见报道。为探究重组表达融合肽Tα1-BP5(r Tα1-BP5)是否具有免疫佐剂特性,本实验设计合成融合肽Tα1-BP5基因,将其克隆至p ET-32a中进行原核表达,并采用MTT法检测其体外活性。同时以rTα1-BP5联合H9N2型禽流感病毒(AIV)灭活疫苗免疫小鼠,检测免疫后小鼠的HI抗体、IgG抗体亚型和细胞因子(IL-4和IFN-γ)的分泌水平,并通过攻毒试验评价其对小鼠的免疫保护作用。结果显示,rTα1-BP5在大肠杆菌中获得可溶性表达;rTα1-BP5能够增强机体免疫后HI抗体、平衡IgG1和IgG2a抗体、提高Th2型(IFN-γ)和Th1(IL-4)型细胞因子的分泌水平,表明rTα1-BP5能够同时增强机体体液和细胞免疫应答。动物免疫保护试验结果显示rTα1-BP5有助于鼠肺脏中H9N2型AIV的清除。以上结果提示,rTα1-BP5具有良好的免疫佐剂的潜能。本研究为新型疫苗佐剂的研究开发奠定了基础。

乳糖诱导胸腺融合肽Tα1-TP5在大肠杆菌中的表达

目的研究用乳糖替代异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂诱导胸腺融合肽Tα1-TP5表达,并优化诱导表达条件。方法在摇瓶发酵条件下,以乳糖作为诱导剂,SDS-PAGE电泳和AlphaEase凝胶电泳图像分析系统研究培养基组成、诱导剂浓度、诱导时机、诱导时间、诱导温度和诱导方式等条件对目的肽Tα1-TP5表达量的影响,并与IPTG诱导结果相比较。结果选用TB培养基,在菌体对数生长的中后期加入终浓度为1 g/L的乳糖,37℃诱导6 h,GST-Tα1-TP5融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,且主要以可溶形式表达,与IPTG的诱导结果相同。分批流加乳糖4次和一次性加入乳糖诱导,融合蛋白表达量无明显差异。结论乳糖可以替代IPTG诱导胸腺融合肽Tα1-TP5的表达。

树突状细胞负载Tα146-162对TAChR预致敏T细胞免疫反应的影响

目的探讨髓源不成熟的树突状细胞(iMDC)负载Tα146-162在TAChR预致敏小鼠中能否诱导免疫耐受。方法Tα146-162负载于体外培养的iMDC,获得Tα146-162-iMDC。流式细胞术分析iMDC上CD11c、MHC-Ⅱ、CD40和CD86的表达。24只小鼠随机分为A1、A2、K1、K2 4组。第0天,A1组、A2组用TAChR+CFA致敏,K1组、K2组用KLH+CFA致敏。第7天,A2组、K2组注射Tα146-162-iMDC,A1组、K1组则注射PBS。第14天,以3H-TdR掺入法检测淋巴细胞增殖反应。结果培养6 d的iMDC中等程度表达CD11c[(63.94±5.11)%]、低表达MHC-Ⅱ[(39.26±5.81)%]、CD40[(26.60±4.03)%]和CD86[(18.41±3.68)%]。与A1组相比,A2组TAChR刺激下淋巴细胞增殖反应显著降低(P<0.05),ConA和KLH刺激下淋巴细胞增殖反应差异无统计学意义(P>0.05)。K1组与K2组在KLH刺激下淋巴细胞增殖反应差异无统计学意义(P>0.05)。结论Tα146-162-iMDC可在TAChR预致敏的C57BL/6小鼠中诱导免疫耐受。

pGEX-4T-1/Tα1-TP5原核表达载体的构建及表达

旨在构建胸腺融合肽Tα1-TP5原核表达载体,并在大肠杆菌中表达。化学合成Tα1-TP5基因,与原核表达载体pGEX-4T-1融合并转化至E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,用SDS-PAGE电泳和A lphaEase凝胶电泳图像分析系统对工程菌表达的蛋白进行分析鉴定。表达的GST融合蛋白经GST琼脂糖凝胶亲和层析和重组肠激酶切割后,电喷雾质谱(ESI-MS)鉴定胸腺融合肽Tα1-TP5。结果显示,成功构建pGEX-4T-1/Tα1-TP5原核表达载体,工程菌表达的GST融合蛋白占全菌总蛋白的27.8%,且主要以可溶形式表达。经ESI-MS鉴定,胸腺融合肽Tα1-TP5的分子量与理论值相符。胸腺融合肽Tα1-TP5在大肠杆菌中得到了高效表达。

渗透休克法从大肠杆菌中提取GST-Tα1-TP5融合蛋白

目的:从大肠杆菌中选择性抽提GST-Tα1-TP5融合蛋白。方法:采用渗透休克法从大肠杆菌中提取GST-Tα1-TP5融合蛋白,优化操作条件,并与超声破碎法进行比较。结果:优化后的渗透休克法从大肠杆菌提取GST-Tα1-TP5融合蛋白可使杂蛋白量含量相对超声破碎法降低一个数量级。结论:渗透休克法可高效提取大肠杆菌表达的GST-Tα1-TP5融合蛋白。

树突状细胞负载Tα146-162对EAMG中Crry、CD59a、CD59b mRNA表达的影响

目的观察实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)小鼠肌肉中Crry、CD59a、CD59b mRNA的表达和Tα146-162-iMDC诱导免疫耐受对三者的影响。方法用GM-CSF、IL-10诱导骨髓细胞分化、增殖为不成熟的髓源性树突状细胞(iMDC),之后将Tα146-162负载其上(Tα146-162-iMDC)。健康雌性C57BL/6小鼠30只,随机分为模型组(A组,12只)、干预组(B组,12只)和正常对照组(C组,6只),A、B组小鼠用电鳗乙酰胆碱受体(T-AChR)免疫诱导EAMG,B组小鼠用Tα146-162-iMDC干预。按照Christadoss标准对小鼠进行EAMG评分,3H-TdR标记检测淋巴细胞增殖反应,RT-PCR方法检测Crry、CD59a、CD59b mRNA表达。结果A、B组小鼠平均临床评分分别是1.67±1.15vs0.33±0.65(P<0.01),发病率分别是75%vs25%(P<0.05)。B组较A组小鼠抗原特异性淋巴细胞增殖反应明显降低(P<0.01)。A组较C组小鼠Crry mRNA、CD59a mRNA表达明显降低(P<0.05);B组较A组Crry mRNA、CD59a mRNA表达明显升高(P<0.05),B组CD59a mRNA与C组相比无显著性差异(P>0.05)。3组小鼠肌肉中均检测不到CD59b mRNA。结论Crry mRNA、CD59a mRNA表达减少可能参与EAMG发生,CD59b可能与EAMG发病无关;Tα146-162-iMDC上调小鼠肌肉中Crry、CD59a mRNA表达及抑制抗原特异性淋巴细胞增殖反应可能是其阻抑EAMG发生的机制之一。

树突状细胞负载Tα146-162治疗实验性自身免疫性重症肌无力小鼠的B细胞活化机制研究

目的从B细胞活化的角度探讨Tα146-162-iMDC干预实验性自身免疫性重症肌无力小鼠(EAMG)的作用机制。方法34只6～8周健康雄性C57BL/6J小鼠,随机分为模型组(A)、干预组(B)和对照组(C)。体外培养树突状细胞,然后负载Tα146-162对干预组小鼠进行干预。从初次免疫起至第90d实验终止前,行EAMG严重性临床评估及发病率的计算。RT-PCR法检测Cbl mRNA表达,Western blot法检测Syk和Lyn蛋白及蛋白磷酸化表达。结果A组发病率高于B组(75%vs25%,P<0.05)。实验终止时两组临床评分分别为1.69±1.12、0.35±0.67(P<0.01)。C组无发病小鼠。A组小鼠的脾脏和淋巴结Cbl mRNA表达水平均明显低于C组小鼠(P<0.01),B组小鼠的脾脏和淋巴结Cbl mRNA表达水平较A组明显升高(P<0.05),但仍低于C组(P<0.05)。A组小鼠的脾脏和淋巴结Syk蛋白和磷酸化表达水平较C组小鼠升高(P<0.01),B组较A组下降(P<0.05),但高于C组(P<0.05);A组小鼠的脾脏和淋巴结Lyn蛋白表达和磷酸化水平较C组小鼠降低(P<0.01),B组较A组升高(P<0.05),但仍低于C组(P<0.05)。结论Tα146-162-iMDC干预,能显著降低EAMG的发病率,改善临床症状,其机制可能与Cbl负性调控B细胞活化有关。

胸腺肽Tα1对乙型肝炎患者细胞因子的影响

本研究用胸腺肽Tα1对26例慢性乙型肝炎进行了治疗,并对患者治疗前后的血清细胞因子进行对比观察。 1

矿泉浴对冠心病患者θ-Tα的影响

目的观察矿泉浴对冠心病患者θ—Ｔ离散度（θ—Ｔα）的影响。方法１３８例冠心病患者随机分为两个组，观察组６９例进行矿泉浴治疗，对照组６９例口服复方丹参片治疗，１４天为一疗程，观察治疗前后θ—Ｔα的变化。结果观察组治疗前后θ—Ｔα差异非常显著，治疗后明显小于治疗前。治疗后两组间比较θ—Ｔα也有显著性差异Ｐ＜０．０１，观察组小于对照组。结论矿泉浴可使冠心病患者θ—Ｔα减小，是治疗冠心病预防心律失常的有效方法。

Tα1螺旋藻培育鲍苗的应用效果研究

在8口23.2 m2的池中,于水温12.5~17.7℃、盐度30的传统养殖模式下,研究饲料中定量添加Tα1螺旋藻喂养鲍苗的培育效果。试验组和对照组分别投放壳长（3.68±0.04）mm和（3.66±0.07）mm,密度（5755±429）粒·m-2和（5 733±169）粒·m-2的鲍苗,经过133 d的养殖,鲍壳长、成活率、日增长分别达到（15.65±0.19）mm和（15.08±0.63）mm、（93.57±0.68）%和（89.25±2.48）%、（90.04±1.49）μm·d-1和（85.81±4.48）μm·d-1。结果表明：添加Tα1螺旋藻培苗,可显著提高鲍苗培育成活率（P〈0.05）,促进鲍苗的生长（P〉0.05）;且壳色泽好、规格较整齐。经酶联免疫吸附法（ELISA）检测鲍苗体内的胸腺素α1含量也表明,添加Tα1螺旋藻能明显提高鲍苗体内的胸腺素α1含量（P〈0.05）。

Tα1对食管癌细胞RNA转染的脐血树突状细胞诱导T细胞杀瘤活性的影响

目的:探讨食管癌细胞RNA转染脐血树突状细胞(dendriti ccells,DCs)对T细胞增殖和CTL特异性抗肿瘤作用的影响,以及Tα1对脐血DCs疫苗的免疫佐剂作用.方法:分离脐血单个核细胞,经rhSCF、rhGM-CSF和rhIL-4诱导和T.Tn细胞RNA转染形成成熟DCs,加入Tα1制备肿瘤疫苗.流式细胞术(FCM)检测各组DCs表型变化;MTT法检测各组脐血DCs诱导T细胞增殖和CTL细胞毒活性.结果:T.Tn细胞RNA转染后组较转染前组脐血DCs高表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD54、CD80和CD86分子(MHC-Ⅰ:70.36±6.09vs8.17±1.93;MHC-Ⅱ:72.03±5.32vs7.64±5.33;CD54:69.36±7.33vs2.05±2.03;CD80:67.21±6.77vs2.33±1.65;CD86:68.85±7.41vs6.73±1.97,P<0.01);与转染前组相比,可显著促进T细胞增殖(10∶1:4.77±0.79vs1.65±0.71;50∶1:3.85±0.57vs1.56±0.13;100∶1:2.89±0.59vs1.19±0.21,P<0.05),并有效诱导CTL的特异性杀瘤活性(10∶1:27.36±8.93vs10.35±2.93;20∶1:44.55±2.36vs11.77±1.03;50∶1:51.08±4.92vs12.75±1.49,P<0.05).而Tα1能显著促进RNA致敏脐血DCs的各种表面分子表达(MHC-Ⅰ:87.88±9.13vs70.36±6.09;MHC-Ⅱ:93.16±3.34vs72.03±5.32;CD54:91.75±3.84vs69.36±7.33;CD80:87.27±8.68vs67.21±6.77;CD86:89.09±6.86vs68.857.41,P<0.05);和刺激T细胞增殖能力(10∶1:8.31±1.78vs4.77±0.79;50∶1:5.97±0.14vs3.85±0.57;100∶1:4.03±0.13vs2.89±0.59,P<0.05);及诱导CTL的能力(10∶1:47.66±4.12vs27.36±8.93;20∶1:56.72±7.24vs44.55±2.36;50∶1:76.48±3.47vs51.08±4.92,P<0.05).结论:Tα1联合食管癌细胞RNA转染脐血DCs可制备高效、特异的肿瘤疫苗,有望成为食管癌生物治疗的新途径.

胸腺肽α1(Tα1)体外抗HBV作用的实验研究

目的:在乙型肝炎病毒(HBV)基因转染的人肝癌细胞系(HepG2)的2215细胞培养中,观察胸腺肽α1(Tα1)对2215细胞的毒性及对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的抑制作用。方法:在HepG2215细胞中加入经2倍稀释的药物,第8天在显微镜下观察细胞病变,并收集细胞培养上清液,ELISA法检测抗原浓度,酶标仪测定OD值。结果:Tα1对2215细胞的最大无毒浓度(TC0)为80μg/ml,根据公式计算半数毒性浓度(TC50)为135μg/ml。Tα1在最大无毒浓度下,对2215细胞分泌的HBsAg的抑制率平均为56.6%、44.1%、10.6%;半数有效浓度(IC50)平均为59.7μg/ml,治疗指数平均为2.47。对2215细胞分泌的HBeAg的抑制率平均为53.5%、43.3%、20.0%;半数有效浓度(IC50)平均为64.4μg/ml,治疗指数平均为2.10。结论:Tα1在2215细胞中培养6天,其无毒浓度对2215细胞分泌的HBsAg和HBeAg有一定的抑制作用。

Tα1对食管癌细胞RNA转染的脐血树突状细胞功能的影响

目的探讨食管癌T.Tn细胞RNA转染脐血树突状细胞(DCs)对T细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)特异性抗肿瘤作用的影响,以及胸腺肽α1(Tα1)对脐血DCs疫苗的免疫佐剂作用。方法分离脐血单个核细胞,经重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人干细胞因子(rhSCF)、重组人IL-4(rhIL-4)诱导和T.Tn细胞RNA转染形成成熟DCs,加入Tα1制备肿瘤疫苗。检测RNA转染后DCs表型变化;MTT法检测各组脐血DCs诱导T细胞增殖和CTL细胞毒活性。结果与转染前比较,T.Tn细胞RNA转染后脐血DCs表面MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ和CD54、CD80和CD86分子水平明显升高(P均<0.05);可显著促进T细胞增殖,有效诱导CTL的特异性杀瘤活性(P<0.05)。而Tα1能显著促进RNA致敏脐血DCs的表面分子表达和T细胞功能(P<0.05)。结论Tα1联合食管癌细胞RNA转染脐血DCs可制备高效、特异的肿瘤疫苗,有望成为食管癌生物治疗的新途径。

胸腺肽Tα1治疗慢性乙型肝炎疗效研究

胸腺肽Tα1(迪美仙)是采用新型工艺生产的富含28个肽Tα1的精制胸腺肽(每支50mg中Tα1不少于0.8mg)。本研究采用迪美仙对40例慢性乙型肝炎(CHB)分轻、中度进行了治疗前后的对比观察。

直接离散的GM(1,1,tα)模型及其适用范围

为提高GM(1,1,tα)模型精度,改进其应用的局限性,提出使用原始序列x(0)构建直接离散的GM(1,1,tα)模型,同时推导以x(0)(1)、x(0)(n)为迭代初始值的表达式,进一步将GM(1,1,tα)模型的适用范围拓展到高增长序列、近幂函数序列及其与齐次指数、近似非齐次指数序列的组合序列,最后通过实例验证了直接离散的GM(1,1,tα)模型具有较好的模拟与短期预测效果。

胸腺肽Tα_1对慢性病毒性肝炎血糖的调节研究

本文研究胸腺肽Tα1对慢性病毒性肝炎的血糖调节.对慢性病毒性肝炎患者的血糖水平与正常对照组进行了对比观察,并对肝炎患者进行了胸腺肽Tα1治疗前后的血糖测定,现报告如下:

重组ProTα对肝癌小鼠Treg细胞和NKG2D阳性细胞的影响

为观察不同时期应用重组胸腺素α原(ProTα)药物干预下肝癌荷瘤小鼠的抑瘤率,并研究其对Treg细胞和NKG2D阳性细胞的影响,将36只昆明小鼠随机分成空白组、荷瘤组、药物干预组,H22小鼠肝癌细胞皮下移植建立荷瘤小鼠模型,腹腔注射重组ProTα,观察7和14d后肝癌荷瘤小鼠的抑瘤率,并检测外周单个核细胞中调节性T细胞(Treg细胞)和NKG2D阳性细胞的比例.结果表明:移植瘤7d后,药物干预组和荷瘤组瘤质量对比无显著差异;而移植瘤14d后,药物干预组瘤质量较荷瘤组有显著减小.荷瘤14d后,荷瘤组较空白组Treg细胞比例升高,NKG2D阳性细胞比例下调,差异显著;而不论是早期药物干预组还是进展期(即移植瘤7d后)药物干预组,Treg细胞比例均显著降低,NKG2D阳性细胞显著升高.由此可见,重组ProTα能够抑制肝癌荷瘤小鼠肿瘤生长,且早期、长期用药效果更好,相关作用机制涉及下调Treg细胞数量从而抑制肝癌细胞免疫逃逸,并上调NKG2D阳性细胞数量从而提高其介导的抗肿瘤效应.

流行性感冒患儿外周血MAIT细胞的免疫生物学特性

目的探讨流行性感冒患儿外周血黏膜相关恒定T(MAIT)细胞的变化及其临床意义。方法选取2023年1—5月就诊于某儿童医院感染科门诊和住院治疗的流行性感冒患儿,分为普通型组和重症型组,同时选择该院体检的健康儿童作为健康对照组。患儿入院24 h内抽血送检,采用流式细胞技术检测MAIT细胞(CD3^(+)CD161^(+)TCRVα7.2^(+)细胞)比例,表达PD-1、CD69、穿孔素、CD107α的MAIT细胞比例,比较各组差异。结果与对照组相比,普通型、重症型患儿外周血MAIT细胞比例逐步下降,表达CD69和穿孔素阳性的MAIT细胞比例逐步升高,三者间比较,差异均有统计学意义(均P<0.05);表达CD107α的MAIT细胞比例比较,差异无统计学意义(P>0.05);PD-1阳性的MAIT细胞比例升高(P<0.05),但普通型、重症型组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论外周血MAIT细胞减少伴免疫活化在流行性感冒发病中起一定作用。

儿童急性早幼粒细胞白血病治疗后继发T淋巴母细胞淋巴瘤1例临床报告

目的总结急性白血病治疗后继发非霍奇金淋巴瘤患儿的临床诊治过程,探讨疾病相关机理。方法回顾性分析1例急性早幼粒细胞白血病(APL)治疗后继发T淋巴母细胞淋巴瘤(T-LBL)患儿的临床资料,并检索急性白血病治疗后继发非霍奇金淋巴瘤的文献报告进行总结。结果患儿,男,10岁,因“间断发热”起病,确诊APL后,在治疗过程中出现骨髓复燃,调整治疗方案后达完全缓解,然而在结束白血病治疗后因淋巴结肿大诊断为T-LBL,经规范化疗再次得以缓解。检索近10年文献,急性白血病治疗后继发非霍奇金淋巴瘤共报告9例,均为成人病例,其中6例患者至报告时均为无病生存状态。结论急性白血病治疗后继发非霍奇金淋巴瘤的发生率低、预后较好。此外,对肿瘤性疾病化疗后的患者,需注意继发性肿瘤的发生,应用先进检测技术可提高对继发性肿瘤致病机制的认知。

基于NFAT5介导的EMT研究益糖康改善高血糖对肾脏早期损伤的作用机制

目的探讨活化T细胞核因子5(nuclear factor of activated T cells 5,NFAT5)对高糖诱导人肾小管上皮HK-2细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响以及益糖康改善高血糖对肾脏早期损伤的作用机制。方法SD雄性大鼠20只,随机分成生理盐水组和益糖康组,每组10只。生理盐水组给予1 mL/100 g生理盐水灌胃,益糖康组给予2.10 g/100 g益糖康煎剂灌胃,连续5 d,腹主动脉取血,离心分离上清。通过高糖诱导HK-2细胞构建早期糖尿病肾病体外模型,并加入相应的药物进行干预。分别采用qRT-PCR和Western blot实验检测转染NC-siRNA(NC-siRNA组)/NFAT5-siRNA(NFAT5-siRNA组)或生理盐水含药血清处理(NS组)/益糖康含药血清处理(YTK组)以及益糖康含药血清处理同时转染GV492-Empty(YTK+GV492-Empty组)/GV492-NFAT5(YTK+GV492-NFAT5组)细胞中NFAT5、E-cadherin以及Vimentin mRNA和蛋白表达水平的改变。再分别采用划痕和Transwell实验检测各组细胞迁移力和侵袭力的改变。结果转染NFAT5-siRNA能够明显抑制NFAT5 mRNA(P<0.05)和蛋白(P<0.05)的表达;与NC-siRNA组相比较,NFAT5-siRNA组细胞中E-cadherin mRNA(P<0.05)和蛋白(P<0.01)的表达水平显著升高,Vimentin mRNA(P<0.05)和蛋白(P<0.01)的表达水平显著降低,细胞的迁移力(P<0.05)和侵袭力(P<0.01)均明显减弱。与NS组相比较,YTK组细胞中NFAT5 mRNA(P<0.05)和蛋白(P<0.05)的表达水平明显降低。转染GV492-NFAT5能够明显促进NFAT5 mRNA(P<0.05)和蛋白(P<0.01)的表达;与YTK+GV492-Empty组相比较,YTK+GV492-NFAT5组细胞中E-cadherin mRNA(P<0.01)和蛋白(P<0.01)的表达水平显著降低,Vimentin mRNA(P<0.05)和蛋白(P<0.01)的表达水平显著升高,细胞的迁移力(P<0.05)和侵袭力(P<0.05)均明显增强。结论在高糖环境下,NFAT5会促进人肾小管上皮细胞发生EMT;益糖康能够通过下调NFAT5表达抑制肾小管上皮细胞发生EMT从而改善高血糖对肾脏的早期损伤。