向日葵Ti T—DNA转化系的原生质体培养和细胞培养

根癌农杆菌离体感染向日葵子叶、下胚轴外植体形成的Ti T-DNA转化组织在激素条件下长期继代培养后,用来进行原生质体培养和细胞培养。适于B6S3转化系和T37转化系原生质体培养的培养基分别为附加不同激素和糖类的C81V和DPD培养基。用液体浅层法培养3～5天时,原生质体开始分裂。10天后形成细胞团。B6S3转化系还可直接从原生质体产生原胚状结构。转化系的细胞克隆均保持着激素自主型生长特性和冠瘿碱合成酶合成特性。

基于重测序鉴定耐盐转基因大豆事件外源T-DNA整合位点及特异性检测

[目的]转基因大豆事件L8014是本研究前期利用农杆菌介导的大豆子叶节高效遗传转化技术体系,将来源于山菠菜的基因BADH导入大豆(Glycine max)‘Williams 82’而获得具有良好耐盐(1.5%NaCl)性状的转基因大豆(该材料已经完成环境释放试验)。T-DNA插入位点侧翼序列的获得与分析对于转基因事件的安全评价及应用非常重要,本文旨在明确该转基因大豆材料的分子特征及其检测方法,以进一步推进安全评价。[方法]利用Southern杂交检测转基因大豆外源基因的拷贝数;基于基因组重测序技术,采用BWA(Burrows-Wheeler-Alignment)方法将重测序数据与T-DNA序列以及大豆基因组序列进行比对分析。[结果]T-DNA在大豆基因组10号染色体上的基因组区间3925017—3926022位点,插入方式为反向插入;结合PCR扩增技术获得外源T-DNA整合位点的左、右边界侧翼序列,基于该序列建立了转BADH基因大豆事件L8014的特异性PCR检测方法。[结论]本研究获得了转基因事件的整合位点及侧翼序列,方法快速、结果可靠,为转基因大豆及其衍生产品的检测提供了技术支撑。

T-DNA标签技术及其在植物功能基因组研究中的应用

综述了T-DNA转移和整合机理的研究进展,植物T-DNA标签的种类和特点及其在功能基因组研究中的应用。

T-DNA插入产生的水稻白化苗突变的遗传分析

在筛选和鉴定水稻T-DNA(含Basta抗性基因Bar)插入纯合体的过程中,观察到1个白化苗的突变体.对该突变体进行遗传分析表明,分离群体出现绿苗和白化苗2种类型,其分离比率为3∶1,符合1对基因的显性遗传.Basta抗性检测、PCR分子检测及Southern杂交证实,该突变体是由单一T-DNA插入所引起的,白化苗性状与T-DNA共分离.该突变材料可用于插入座位的基因克隆.

稻瘟病菌T-DNA插入突变体库构建及致病相关突变体筛选

利用农杆菌T-DNA介导的遗传转化体系转化稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)Y34菌株,平均每转化1.0×106个稻瘟病菌分生孢子可得到约300个抗潮霉素菌株。用该转化体系转化和筛选,获得抗潮霉素菌株6855个。PCR检测结果表明,所有表现抗潮霉素菌株均含抗潮霉素基因,说明抗潮霉素特性是T-DNA携带潮霉素基因插入Y34基因组的表型效应,即抗潮霉素菌株是T-DNA插入突变体。对56个突变体DNASouthern检测结果表明,有27个突变体是单拷贝插入,突变体T-DNA插入拷贝数平均为1.43。随机取1600个突变体进行致病力测定,结果发现23个突变体完全丧失致病能力。

T-DNA插入产生的水稻迟抽穗突变体的遗传分析

在筛选和鉴定水稻T-DNA插入纯合体的过程中,观察到一个迟抽穗的突变体。对该突变体进行遗传分析的结果表明,分离群体后代中出现正常抽穗、迟抽穗和特迟抽穗3种类型,分离比率为1∶2∶1,符合一对基因的不完全显性遗传;对突变体及其后代分离群体做Basta抗性检测及PCR分子检测,证实该突变体是由T-DNA插入所引起的,突变性状与T-DNA共分离。该材料可用于插入座位的基因克隆。

可去除选择标记的DREB基因双T-DNA载体共转化玉米

通过体外重组构建双T-DNA双元载体pCDMARpWDT-Hyg,选择标记基因hpt(hygromycin phospho-transferase)和抗逆转录因子基因DREB分别位于两个独立的T-DNA。用农杆菌介导法转化玉米胚性愈伤组织,通过在抗性培养基上严格筛选,在获得的再生转化植株中,同时整合hpt基因和DREB基因的共转化率达到26·3%。该转化系统的建立为下一步得到无选择标记的转基因植株奠定基础。此外,本实验还通过gus基因的瞬时表达分析了农杆菌转化玉米的影响因素。

水稻小粒矮突变性状与T-DNA插入标签的共分离检测

从T-DNA水稻标签系中发现1个标签系中出现了小粒矮(sgd)突变性状的分离。为克隆该突变基因和进行基因功能研究,对该突变体进行了遗传分析。该标签系存在多个插入事件,且T3代发现目标突变性状分离系中,另一个非目标插入事件已经纯合,故特异PCR检测不能确认小粒矮突变性状与T-DNA插入共分离。但通过TAIL-PCR方法,获得了插入点侧翼的水稻基因组序列,并证实该侧翼序列与小粒矮突变性状共分离。

番木瓜β-Gal基因RNAi双T-DNA植物表达载体的构建及其遗传转化的初步研究

克隆了番木瓜(Carica papaya L.)果肉的细胞壁水解关键酶β-半乳糖苷酶(β-GAL)基因保守区,将其反向重复插入载体pKANNIBAL,构建RNAi中间表达载体pKAN/RG,将其上的发夹结构取代经改造的载体pCAMBIA1300上hptⅡ基因,构建中间表达载体p1300-/MFRG,分离单T-DNA区段,与载体pCAMBIA2301构建RNAi双T-DNA植物表达载体p2301/TTRG。酶切分析和PCR检测表明,p2301/TTRG已被成功导入农杆菌EHA105。通过遗传转化,初步获得了GUS染色呈阳性且具Kan抗性的番木瓜胚性愈伤组织。

T-DNA插入麝香百合的研究(英文)

采用2步外植体法结合比较成熟的农杆菌介导T—DNA插入技术转化麝香百合，为快速选育百合新品种奠定基础。

双T-DNA共转化获得转基因番木瓜

番木瓜采后期间的迅速软化现象,导致果实的货架期十分短暂。利用RNAi-β-Gal双T-DNA植物表达载体p2301/TTRG,通过农杆菌介导,探索了液体振荡转化法和浸泡转化法对番木瓜胚性愈伤组织共转化效率的影响。经抗生素敏感性测定,将卡那霉素筛选质量浓度确定为150mg·L-1。在该质量浓度下,2种方法均获得了转基因再生植株,但转化效率仍较低。正交试验结果表明,浸泡转化法中各处理因素的作用大小为:AS质量浓度>共培养时间=菌液光密度值=侵染时间,最佳共转化组合为:100μmol·L-1AS+菌液光密度值0.2+侵染20min+共培养3d。经PCR和Southern杂交检测,所获得的5株再生植株中有2株为共转化的结果,诱导了其中1株生根并移栽。为进一步选育无选择标记基因的抗软化转基因番木瓜奠定了基础。

棉花T-DNA标签雄性不育突变体的遗传分析

利用农杆菌介导T-DNA插入得到棉花雄性不育突变体,与野生型陆地棉(Gossypium hirsutumL.)Coker312杂交得到F1代。F1代植株出现了不育与可育两种性状的分离,分离比是1∶1。对F1代进行形态学观察、卡那霉素和除草剂抗性鉴定、PCR扩增检测以及遗传学分析,证实雄性不育突变性状的表现与T-DNA插入共分离,从而认为突变是由T-DNA插入引起的显性杂合突变,这为利用T-DNA标签法进行雄性不育有关基因的克隆奠定了基础。

花生高蛋白转化体T-DNA整合位点侧翼序列分析

利用山东省花生研究所分子育种实验室改建的植物表达载体,采用自创的农杆菌直接注射法转化花生品种花育22号。运用近红外扫描技术分析单粒花生主要脂肪酸、含油量和蛋白质含量,获得了蛋白质含量明显提高的转化体。通过DNA walking技术获取T-DNA左边界侧翼序列3条、右边界侧翼序列1条。经Blast分析,在GenBank中找到有一定相似性的序列。这是花生上应用T-DNA标签法的首次尝试。

CMV-IgM、CMV-DNA及外周血T淋巴细胞在巨细胞病毒肝炎患儿中的变化及其意义

目的:探讨巨细胞病毒(CMV)肝炎患儿血清CMV-IgM、CMV-DNA及外周血T淋巴细胞的变化及其意义。方法:选取阳江市人民医院2018年8月-2021年8月确诊的98例CMV肝炎患儿(CMV组)及同期在本院儿保科进行常规保健的100例健康婴幼儿(对照组)。对比两组的CMV-IgM、CMV-DNA、外周血T淋巴细胞水平,分析T淋巴细胞与患儿肝功能损伤程度的关系。结果:CMV组的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测定值高于对照组,血清白蛋白(ALB)测定值低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。CMV组的外周血CD3^(+)CD8^(+)T细胞测定值高于对照组,CD3^(+)CD4^(+)T细胞、CD4^(+)/CD8^(+)测定值低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。CMV组的血清CMV-IgM阳性率为87.76%、CMV-DNA阳性率为64.29%,均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。CMV肝炎患儿的CD3^(+)CD4^(+)T细胞与ALT、AST、总胆红素(TBIL)均呈负相关性,CD3^(+)CD8^(+)T细胞与ALT、AST、TBIL均呈正相关性,CD4^(+)/CD8^(+)与ALT、AST、TBIL均呈负相关性(P<0.05)。CMV-Ig M诊断CMV肝炎患儿的敏感度为87.76%、特异度为86.00%;CMV-DNA诊断CMV肝炎患儿的敏感度为64.29%、特异度为100%。结论:CMV肝炎患儿血清呈现明显的免疫功能失衡,并且与肝功能受损程度有关,CMV-IgM诊断CMV肝炎敏感度较高,CMV-DNA诊断CMV肝炎患儿特异度较高,临床上可考虑将二者联合检测,提高诊断效率。

拟南芥T-DNA插入突变体scc8-D的蛋白质组学研究

采用双向凝胶电泳对拟南芥T-DNA插入突变体scc8-D和对照材料cry1cry2的植株总蛋白进行了分离,通过考染显色,获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱.然后选取30个差异蛋白质点用MALDI-TOF-TOF-MS进行肽质谱指纹图分析,有22个蛋白质点得到了可靠鉴定.其中在scc8-D突变体中有3个蛋白上调,16个蛋白下调,有3个蛋白仅在cry1cry2中表达.分析发现,这些差异蛋白可能参与了碳水化合物代谢、光合作用、光呼吸、胁迫响应、蛋白质合成和氧化还原平衡等过程.这些蛋白中光合蛋白占32%,说明这些与矮化相关的调节性蛋白和功能性蛋白丰度的表达受到光的调控,从而抑制了植物下胚轴的伸长.

T-DNA在丝状真菌中的插入突变及其应用前景

利用根癌农杆菌介导的转化系统已经在酵母菌和多个属种的丝状真菌成功建立起相应的T-DNA 插入突变体系,使之有可能成为真菌生理学、生物化学以及发育生物学相关理论研究的潜在工具.综述了丝状真菌质粒DNA转化和T-DNA转化的差别、T-DNA插入突变的主要特点和优点、T-DNA转化丝状真菌的方法以及T-DNA已转化的丝状真菌种类,并对T-DNA插入突变在丝状真菌中的应用前景进行了分析.

T-DNA标签法在水稻功能基因组研究中的应用

农杆菌介导的T-DNA标签法是近年发展的一种有效的分子生物学技术。综述了T-DNA标签法的特点及其在水稻功能基因组研究中应用的进展。

利用双T-DNA载体获得无筛选标记的转基因猕猴桃

以美味猕猴桃品种米良1号的当年生嫩枝及叶片为外植体,构建了1个双T-DNA载体pCAMBIA1300-actin-term-2,通过根癌农杆菌EHA105菌株作为介导,将aco反义基因导入米良1号猕猴桃中。通过后代植株的遗传分离,以期获得无潮霉素筛选标记的转基因植株。结果表明,愈伤组织预培养20 d,侵染30 min,EHA105菌液浓度Dnm=0.6,培养5 d,经PCR法检测证明aco反义基因已转入转化植株基因组中。

农杆菌T-DNA介导的桑树遗传转化研究进展

农杆菌介导外源基因是目前研究最多,应用最广的植物转基因方法。本文对农杆菌介导的植物遗传转化机理,以及T-DNA介导在植物基因组中的加工、转移、整合的分子机理和桑树遗传转化的近几年研究进行了综述,并对桑树基因工程进行了展望。

共转化水稻植株T-DNA共整合结构的分子分析

为研究共转化水稻的T-DNA共整合结构，本研究利用分别含有HPT、GFP和mCherry基因的T—DNA载体共转化水稻，从共转化植株获得了22个由两种T—DNA共整合形成的串联结构和25个关于相同T—DNA的多拷贝结构。序列分析结果表明，相邻T-DNA通过LRRL、RLLR和LRLR模式相互连接，由RB参与形成的T-DNA连接区均发生RB序列的完全缺失，在LB参与的T-DNA连接区，LB发生不同数目的碱基缺失或其3＇末端的1个C碱基发生C→T颠换，因而使T-DNA连接区表现多种变异类型。此外，伴随着RB或LB边界的完全缺失，其边界内侧序列也缺失1-643bp。在共转化水稻植株的T-DNA连接区不存在拟南芥相关报道所述的填充DNA序列。研究结果为深入解析禾谷类植物T—DNA共整合的分子机理奠定了重要基础。