含绿色荧光蛋白和小鼠T—bet基因双顺反子真核表达载体的构建及其在A549细胞中的表达

目的构建一种带有绿色荧光蛋白（GFP）和小鼠T—bet基因双顺反子的新型真核表达载体pCI—mT—bet—IRES—GFP。方法利用脑炎心肌炎病毒（EMCV）的内部核糖体进入位点（IRES），将GFP的cDNA与小鼠T—bet基因（mT—bet）连接到真核表达载体pCI中，构建含GFP和mT—bet基因双顺反子的重组质粒。结果成功构建了含GFP和mT—bet基因双顺反子的真核表达载体。荧光显微镜下可观察到发绿色荧光的转基因细胞。结论含绿色荧光蛋白和mT—bet基因双顺反子真核表达载体的构建为哮喘基因治疗研究提供了新的生物表达体系。

淋巴细胞功能相关抗原-1／细胞间黏附分子-1介导的细胞因子诱导的杀伤细胞体外抑瘤机制

目的 探讨淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）／细胞间黏附分子-1（ICAM-1）介导的细胞因子诱导杀伤细胞（CIK）的体外抑瘤机制。方法从白血病患儿外周血分离淋巴细胞，经过干扰素-y（IFN-1）、抗CD，单克隆抗体（CD，McAb）、白细胞介素-2（IL-2）诱导并与树突状细胞（DC）共培养，获得大量的DC—CIK。在经10、20μg／ml等不同质量浓度小鼠抗人I．FA一1单克隆抗体处理后，采用Mrrr法研究DC—CIK细胞对多种白血病细胞株的杀伤活性，RT—PCR与Westernblotting方法检测GATA-3和T-bet基因表达水平的变化。ELISA方法测定DC—CIK细胞释放细胞因子IL-12、IFN一叮、肿瘤坏死因子-α[（TNF—d）的表达水平。结果诱导后的DC—CIK细胞形态规则，经不同浓度的LFA-1单克隆抗体处理后，M啊结果：20雌g／mlLFA-1单克隆抗体封闭组DC—CIK细胞对B95细胞杀伤作用下降最为明显（t=10．138，P〈0．05）；RT．PCR与Westernblotting结果：20μg／mlLFA-1单克隆抗体封闭的B95细胞组，GATA-3基因mRNA水平和蛋白水平表达增加最为明显（仁16．386，P〈0．05：t=22．652，P〈0．05）；同时T—bet基因mRNA水平和蛋白水平表达降低最为明显（t=17．728，p〈0．05；t=7．452，P〈0．05）；ELISA结果：20μg／mlLFA-1单克隆抗体封闭的B95细胞组中细胞因子IL-12、IFN-γ、TNF—d分泌水平下降最为明显（t=21．621，P〈0．05；t=13．739，P〈0．05；t=15．278，P〈0．05）。结论GATA-3和T—bet基因参与了LFA-1／ICAM-1介导的DC—CIK抑瘤途径，并且通过分泌Th1型细胞因子IL-12、IFN-γ、TNF-α等发挥抑瘤作用。