胰蛋白酶原基因与T淋巴受体Vβ7.2片段之间的间隔序列分析

目的鉴定人类T淋巴细胞受体β链基因(Tcell receptor beta-chain,TCRβ)上两个毗邻基因,即胰蛋白酶原基因(cationictrypsinogen,PRSS1)与TCR Vβ7.2片段之间的间隔序列在胰腺炎和健康人群中的分布情况。方法对来自3位胰腺炎患者及2位健康体检者的DNA样本利用特异引物进行聚合酶链反应(PCR)扩增,产物经电泳、纯化后直接测序,并分析该序列的碱基在胰腺炎组和正常人群中的组成情况。结果利用自行设计的引物在2份胰腺炎患者外周血DNA样本中扩增出片段长度约为2.6 kb的条带,DNA测序结果显示两个毗邻基因之间的片段在健康人群和胰腺炎人群中均不是稳定组成。结论TCRβ序列中胰蛋白酶原基因(PRSS1)与TCR Vβ7.2基因之间间隔序列存在不稳定性。

慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴细胞受体β链V区家族的表达及意义

目的探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血T淋巴细胞受体β链V区(TCR BV)各家族谱系的表达及其临床意义方法选择32例CHB患者(CHB组)及20例健康体检者(健康对照组),分别采集其外周血、肝素钠抗凝,分离单个核细胞,提取RNA并应用RT-PCR扩增TCR RV的24个家族,进行两组间扩增产物定量分析结果 CHB组△Ct5、△Ct7、△Ct15、△Ct22、△Ct23值与健康对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)结论 CHB组TCR BV 24个家族BV5、BV7、BV15、BV22、BV23的扩增产物含量均较健康对照组下降。

受体T淋巴细胞克隆的建立及其抗原特异性的检测

目的 建立受体T淋巴细胞克隆后 ,进一步分析检测该克隆针对供体的抗原特异性。方法 供体鼠脾细胞免疫受体鼠 ,再分离、纯化受体鼠T细胞 ,克隆受体T细胞。将动物分组免疫 ,对各组受体作电镜观察淋巴细胞超微结构、MTT法测定淋巴细胞增生试验以及流式细胞分析T细胞亚群的变化 ,分析检测该克隆针对供体的抗原特异性。结果 ①受体针对供体抗原特异性T淋巴细胞克隆稳定建立 ;②经免疫组的受体T细胞超微结构改变显著 ,淋巴细胞增生试验及流式细胞分析结果与对照组的差异有显著性意义 (t>t0 0 5)。结论 成熟T淋巴细胞 ,在一定条件下仍可发生分裂和增生 ,形成克隆。通过供体脾细胞抗原特异性刺激 。

慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴细胞受体谱型特征及其与干扰素抗病毒近期疗效的关系

目的了解慢性乙型肝炎(CHB)患者细胞免疫功能,并探讨与干扰素-α抗病毒治疗早期病毒学应答的关系。方法入选19例接受干扰素-α治疗的CHB患者,治疗前收集外周血5 mL,分离并提取单个核细胞(PBMC)中的总RNA,利用反转录-荧光定量聚合酶链反应扩增T细胞受体(TCR)各β链可变区(BV)家族互补决定区3(CDR3)基因,溶解曲线分析各BV家族CDR3谱系的克隆性增生情况,同时观察治疗前及治疗3个月乙肝病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)、肝功能水平变化。结果 19例CHB患者治疗前外周血TCR BV家族CDR3谱型均发生不同程度的单、寡及偏峰性克隆增生;治疗3个月时谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平及HBV-DNA载量较治疗前均显著下降(P<0.01);病毒学应答组较无应答组TRBV CDR3克隆增生异常率、HBV-DNA载量及ALT水平差异均无统计学意义(P>0.05),应答组AST水平显著高于无应答组(P<0.05)。结论 CHB患者外周血T淋巴细胞存在不同程度的克隆性增生,且细胞免疫功能与干扰素-α抗病毒治疗的早期病毒学应答效果间无相关性,采用细胞免疫功能状态来评估干扰素抗病毒近期疗效存在局限性。

胰蛋白酶原基因突变影响T淋巴细胞受体对乙型肝炎病毒表面抗原的应答

目的研究胰蛋白酶原基因(PRSS1)不同的基因型对乙型肝炎病毒表面抗原的反应性。方法将8例携带PRSS1 A121T(c.361 G>A)突变、12例PRSS1基因沉默突变D162D(c.486 C>T)的胰腺炎患者和16例健康体检者的外周血淋巴细胞分别加于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)衣壳抗原和0.9%生理盐水进行体外培养,在0、12、24、36、48、72 h计数点对不同组别的淋巴细胞进行充池计数并折算成增殖率,同时用流式细胞术检测CD4、CD8的表达情况,并对不同基因型胰腺炎患者的乙型肝炎病毒表面抗体(hepatitis B surface antibody,anti-HBs)水平在病程中变化情况进行统计分析。结果携带PRSS1基因A121T突变的胰腺炎患者的anti-HBs水平在胰腺炎病程中波动较大,而携带沉默突变的胰腺炎患者与健康对照无显著性差异,在外周血淋巴细胞刺激增殖实验中A121T突变的胰腺炎患者对HBV的反应性呈减弱状态,而沉默突变的胰腺炎患者与健康对照无显著性差异,流式细胞术检测显示PRSS1基因A121T突变的胰腺炎患者的CD4/CD8比值降低。结论来自胰蛋白酶原基因不同基因型的淋巴细胞对乙型肝炎病毒表面抗原的反应性不一,胰蛋白酶原基因突变会干扰T淋巴细胞受体对乙型肝炎病毒表面抗原的反应性。

重症联合免疫缺陷病新生儿T淋巴细胞受体切割环筛查概况

重症联合免疫缺陷病（Severe combinedimmunodeficiency，SCID）是一组细胞免疫缺陷、同时累及体液免疫的原发性免疫缺陷病（primary immunodeficiency,PID），根据有无B淋巴细胞，可将SCID分为T。

嵌合抗原受体T淋巴细胞治疗多发性骨髓瘤疗效及安全性的Meta分析

背景多发性骨髓瘤(MM)是一种浆细胞恶性肿瘤,目前尚无法治愈,面临复发与难治的困境。嵌合抗原受体T淋巴细胞(CAR-T)是一种在MM治疗中有巨大潜力的新型免疫疗法,但目前关于其疗效与安全性的评价较少。目的系统评价CAR-T治疗MM的疗效及安全性,为其安全高效应用提供循证医学证据。方法计算机检索PubMed、EMBase、The Cochrane Library数据库,筛选自建库至2019年11月已发表的CAR-T治疗MM的临床试验英文文献,以总反应率、严重不良事件(AEs)发生率(≥3级)、细胞因子释放综合征(CRS)发生率为结局指标,使用R软件进行单组率的Meta分析,并按照预处理方案、共刺激分子、CAR-T抗原类型分组进行亚组分析及Meta回归分析。结果共纳入8项临床研究,包括191例患者,Meta分析结果显示:CAR-T治疗MM的总反应率为0.88〔95%CI(0.83,0.93)〕,严重AEs发生率为0.90〔95%CI(0.83,0.98)〕,CRS发生率为0.92〔95%CI(0.85,1.00)〕。亚组分析及Meta回归分析结果提示:不同预处理方案MM患者严重AEs发生率、CRS发生率比较,差异均有统计学意义(P=0.013,P<0.001);其中,Flu+Cy组、Cy组、无预处理组严重AEs发生率、CRS发生率高于HDM+ASCT组(P<0.05)。共刺激分子4-1BB组总反应率高于CD28组,严重AEs发生率低于CD28组(P<0.05)。不同抗原类型MM患者总反应率、严重AEs发生率、CRS发生率比较,差异均有统计学意义(P=0.004、0.049、0.023);其中,BCMA组总反应率低于LCAR-B38M组、BCMA+CD19组,严重AEs发生率、CRS发生率高于CD19组(P<0.05);LCAR-B38M组、BCMA+CD19组严重AEs发生率、CRS发生率高于CD19组(P<0.05)。结论CAR-T治疗MM具有良好的疗效,虽然有一定的可控安全风险。预处理方案、共刺激分子以及CAR-T抗原类型均是影响疗效及安全性的因素。因纳入研究样本量较少、质量不一,上述结论尚待大样本、高质量随机对照临床试验进一步验证。

嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞治疗肺癌的研究进展和挑战

近年来,免疫疗法尤其是单克隆抗体靶向药物越来越多地应用于肺癌的临床治疗,但仍有很多局限性。嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞(chimeric antigen receptor gene modified-T lymphocytes,CAR-T)疗法对于部分B细胞淋巴瘤和白血病的疗效显著,也为实体瘤的免疫治疗开辟了新途径。肺癌CAR-T疗法的热门靶点包括间皮素(MSLN)、黏蛋白突变体(TnMUC1)、表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2(HER2)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)和δ样配体3(DLL3)等,但相关临床研究均处于早期探索阶段。所面临的主要障碍包括脱靶毒性、肿瘤免疫抑制微环境和CAR-T细胞体内效能不足等。通过基因编辑改进CAR结构、设计多靶点CAR或组合应用多靶点CAR-T细胞、精细调控CAR-T细胞体内动态分布、改进给药方式或联合其他免疫治疗等策略可能有助于解决这些问题。

嵌合抗原受体T淋巴细胞免疫疗法在原发性肝癌中的应用

原发性肝癌具有恶性程度高、进展快、易复发转移和病死率高等特点,因此大多数患者就诊时已发生肝内或肝外转移,失去手术治疗机会。嵌合抗原受体T淋巴细胞(CAR-T)免疫疗法已在B细胞急性淋巴性白血病治疗中取得了较好的效果,其在原发性肝癌、胰腺癌、胃癌以及前列腺癌等实体瘤中的应用也陆续开展了临床试验。本文综述了CAR-T免疫疗法在原发性肝癌临床试验中的疗效,并讨论了其在临床应用中需攻克的难题,如缺乏适宜的肿瘤靶点、肿瘤微环境对CAR-T的抑制作用以及CAR-T对肿瘤组织的浸润性差等,以期为临床研究提供参考。

T淋巴细胞受体与多发性硬化

免疫性T淋巴细胞在多发性硬化(MS)的发病中有重要地位,国外关于MS患者T淋巴细胞受体β链可变区的研究显示MS患者T淋巴细胞受体β链可变区的某些区段会有克隆性扩增,并且与临床类型、病程、MRI表现、扩展残疾状态评分有一定关系。本文就MS患者T淋巴细胞受体β链可变区的表现进行综述。

基因片段扫描检测T细胞受体多样性运用于益艾康胶囊治疗艾滋病的效果观察

目的:利用基因片段扫描建立检测T细胞受体(T cell receptor,TCR)β链多样性的方法,并探讨运用其观察益艾康胶囊治疗艾滋病疗效的效果。方法:①收集17例健康者外周血液样本,提取基因组DNA,设计多重荧光引物,采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)分别扩增TCRβ链互补决定区3(CDR3)的2个V-J重组区和1个D-J重组区,以分子量内标(Liz-500)为标准品,利用毛细管电泳技术使用一代测序仪进行基因片段扫描,最后通过GeneMapper ID-X数据分析软件,根据荧光信号差异识别PCR产物,并对数据进行自动分析。②从样本储存库中筛选40例HIV/AIDS患者在益艾康胶囊治疗前及治疗1年时的血液样本,采用上述方法检测TCRβ链CDR3重组区多样性,从峰形、目标区域曲线下面积、离散度等方面评估其变化情况。结果:①Liz-500可在分子量50~500 bp之间扫描出15条标记片段,用以判定目标片段长度。样本DNA完整,可检测出300 bp以上扩增峰。②健康对照组TCRβ链A/B/C管(其中A/B管为V-J区,C管为D-J区)峰形均呈现类似钟形的正态分布;③TCRβ链C管益艾康胶囊治疗前、后曲线下面积差异有统计学意义(P<0.05),即益艾康胶囊治疗后HIV/AIDS患者TCRβ链D-J区基因重组多样性较治疗前有所增加;④治疗前、后TCRβ链各管离散度均大于健康对照组(P<0.05)。结论:采用基因片段扫描检测T淋巴受体多样性,可以从不同角度分析益艾康胶囊对艾滋病的治疗效果,进而反映机体免疫系统状态。

丙卡特罗联合雾化吸入布地奈德治疗哮喘患儿的临床疗效及对T淋巴细胞趋化因子受体3水平的影响

目的探讨丙卡特罗联合雾化吸入布地奈德治疗哮喘患儿的临床疗效及对T淋巴细胞趋化因子受体3(CXCR3)水平的影响。方法选取2019年1月至2021年6月深圳大学总医院收治的61例哮喘患儿作为研究对象,采用随机摸球法分为观察组(n=31)与对照组(n=30)。对照组给予常规治疗联合丙卡特罗治疗,观察组在对照组基础上联合雾化吸入布地奈德治疗,比较两组治疗前后肺功能指标、血清炎症因子及CXCR3表达水平。结果治疗后,两组达峰时间比(TPEF/TE)、达峰容积比(VPEF/VE)均高于治疗前,每公斤体质量潮气量均大于治疗前,且观察组TPTEF/TE、VPEF/VE均高于对照组,每公斤体质量潮气量大于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后,两组血清白细胞介素-8(IL-8)及白细胞介素-4(IL-4)水平均低于治疗前,干扰素-γ(IFN-γ)水平均高于治疗前,且观察组IL-8及IL-4水平低于对照组,IFN-γ水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后,两组CXCR3水平均低于治疗前,且观察组低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论丙卡特罗联合雾化吸入布地奈德可明显改善哮喘患儿的肺功能,减轻炎症反应,降低CXCR3水平。

寻常型天疱疮患者外周血T细胞受体β链可变区CDR3基因克隆谱型分析

目的:探讨寻常型天疱疮(PV)患者外周血T细胞受体(TCR)互补决定区(CDR3)基因谱型变化,了解克隆扩增的T细胞与自身免疫性疾病的相互关系。方法:采用免疫扫描谱型分析技术,分析6例正常人外周血单个核细胞TCRβ链可变区(BV)CDR3谱型分布特征以及6例PV患者CDR3谱型变化情况。结果:6例正常人TCRBVCDR3谱型均符合正态分布,6例PV患者TCRBVCDR3谱型均出现多态性降低,BV亚家族单/寡克隆增生。结论:PV患者外周血TCR可变区β链CDR3谱型异常可能与PV发病有关。

难治性天疱疮自体外周血干细胞移植后T细胞受体克隆性的分析

目的探讨难治性天疱疮患者自体外周血干细胞移植(APBSCT)前、后T细胞抗原受体β链(TCRβ)互补决定区3(CDR3)基因表达谱型变化,深入了解天疱疮发病机制以及患者造血干细胞移植后T细胞克隆的免疫重建特点。方法应用RT-PCR方法扩增天疱疮患者移植前、后外周血单个核细胞24个TCRβ CDR3区段基因序列,分析其基因表达情况。采用免疫扫描谱型分析技术,分析正常人外周血单核细胞TCRβ链CDR3谱型分布特征,以及难治性天疱疮患者干细胞移植前、后CDR3谱型变化情况。结果动员前天疱疮患者TCRβ CDR3谱型均出现异常,表现为一定程度的T细胞单(寡)克隆增生性表达;移植后12个月内仍出现部分表达缺失及寡克隆表达;而后T细胞克隆分布渐趋于正常,CDR3恢复多态性。结论难治性天疱疮患者外周血T细胞表现单(寡)克隆增生,CDR3多态性降低,可能与其发病机制有关。APBSCT后的免疫功能重建恢复了CDR3的多态性,提示造血干细胞移植是治疗难治性天疱疮的有效手段。

T淋巴细胞激活与凋亡的信号转导及其分子机制

研究发现,人T淋巴细胞抗原受体复合物(TCR/CD3)中,TCR负责接受抗原刺激,CD3负责转导抗原刺激信号。抗TCR或抗CD3抗体的刺激不仅可以激活T淋巴细胞,也可以导致胸腺细胞、激活后的或转化的T淋巴细胞凋亡,但其分子机制和信号转导途径还不清楚。本文着重介绍了近年来这方面的研究工作进展。首先,利用人CD3ε过量表达的转基因小鼠发现,CD3ε分子的过量表达可阻断胎鼠的胸腺细胞发育,而在小鼠出生后,促进小鼠胸腺细胞的凋亡,随着年龄增加,胸腺细胞凋亡的数目增多。进而采用基因定点突变和基因转移等分子生物学研究技术,构建了CD8胞外区与跨膜区和CD3ε胞内区的融合分子及其突变分子,转染CD8^-的T淋巴细胞后,建立了细胞凋亡模型。利用此细胞凋亡模型,发现T细胞激活和凋亡的信号转导均是通过CD3ε分子的胞内区免疫酪氨酸受体激活基序(ITAM)中的2个酪氨酸转导的,其中任何1个或2个酪氨酸突变,均可阻断细胞信号的转导;在T细胞凋亡的过程中,立早基因Nur77和细胞凋亡基因fas表达显著增加,但未发现fas配体表达增加;在T细胞激活过程中,3-磷脂酰肌醇激酶P85α亚基与CD3ε-ITAM中的2个酪氨酸特异性地结合,其中任何1个酪氨酸突变,均大大减低P85α与CD3ε-ITAM的结合能力;

IL-21和CCL19修饰可提高NKP30 CAR-T细胞对肺癌的杀伤效率并促进其肿瘤浸润

目的探讨细胞因子IL-21和趋化因子CCL19修饰的NKP30 CAR-T细胞是否增强对肺癌的杀伤和浸润作用。方法在NKP30 CAR基础上融合基因IL-21和CCL19构建IL-21-CCL19 NKP30 CAR;CAR-T细胞的培养使用CD3CD28单抗及细胞因子IL-2刺激;流式细胞术检测免疫细胞表型;迁移实验检测IL-21对免疫细胞的迁移作用;乳酸脱氢酶(LDH)及成球实验检测CAR-T细胞的杀伤及浸润能力;酶联免疫斑点技术(ELISPOT)检测IFN-γ的分泌数量;ELISA检测IL-21及CCL19的分泌情况;体内实验中,将肿瘤细胞显微注射到斑马鱼卵黄囊,构建斑马鱼移植瘤模型,24 h后将免疫细胞注射至同样部位,体式荧光显微镜拍摄荧光。结果NKP30配体(B7H6)在正常组织及血液细胞不表达,在肺癌细胞上高表达(90%以上)。IL-21-CCL19 NKP30 CAR-T细胞与NKP30 CAR-T细胞和常规T细胞相比,具有更强的增殖能力、迁移能力及中心记忆T细胞的形成(P<0.001),免疫抑制分子CTLA4与PD1显著降低(P<0.005),对肺癌细胞具有更强的杀伤能力(P<0.001),伴随IFN-γ数量明显增加(P<0.001)。IL-21-CCL19 CAR-T细胞杀伤肺癌细胞中产生大量细胞因子IL‑21(3152.33±526.74 pg/mL)和趋化因子CCL19(1853±211.95 pg/mL)。体内实验中,CAR-T细胞和普通T细胞比较,具有较强的杀伤能力和增殖能力,但2种CAR-T细胞无明显差异(P>0.05)。结论IL-21-CCL19 NKP30 CAR-T细胞更容易浸润到肿瘤内部,有效杀伤肿瘤细胞,同时产生更多的记忆T细胞。

CAR-T细胞治疗淋巴造血系统恶性肿瘤临床试验设计相关问题的考虑

嵌合抗原受体T淋巴细胞(CAR-T)在淋巴造血系统恶性肿瘤,如B淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤等的治疗中展现出非常有吸引力的治疗前景。目前有多个课题申请人向中国国家药品监督管理局药品审评中心提交新药临床试验申请,其中很多CAR-T细胞临床试验课题在受试者筛选、疗效预后指标、风险控制等方面存在共性问题,可能影响受试者的安全性和疗效判断。药品审评中心通过总结国内外临床试验设计方面的经验并与国内临床专家交流探讨,对上述共性问题形成了若干考虑,供申办方或研究者开展药品注册临床试验时参考。

慢性肾病患者外周血T淋巴细胞及NK细胞中TIGIT的表达和意义

目的探讨慢性肾病(CKD)患者外周血T淋巴细胞及NK细胞中基于T淋巴细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸的抑制性结构域(TIGIT)的表达及意义。方法选取2020年9月至2021年12月在江西中医药大学附属医院肾病科治疗的97例CKD 2~4期患者作为CKD组,同期体检的23例健康志愿者作为健康对照(HC)组。采用流式细胞术检测CD4^(+)T淋巴细胞、CD8^(+)T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞TIGIT的表达水平,比较CKD组与HC组及不同CKD分期患者各淋巴细胞亚群TIGIT的表达差异。分析TIGIT的表达水平与临床实验室指标的相关性。结果与HC组相比,CKD组CD4^(+)T淋巴细胞、CD8^(+)T淋巴细胞以及NK细胞TIGIT的表达水平均升高(P<0.05)。CKD组CD4^(+)T淋巴细胞、CD8^(+)T淋巴细胞以及NK细胞TIGIT的表达水平随CKD分期的增加而有升高趋势,CKD 4期患者CD4^(+)T淋巴细胞TIGIT的表达水平高于CKD 3期和2期患者,差异均有统计学意义(P<0.05),CKD 4期患者CD8^(+)T淋巴细胞和NK细胞TIGIT表达水平高于CKD 2期患者,差异有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关性分析显示:CD4^(+)T淋巴细胞数和CD8^(+)T淋巴细胞数分别与CD4^(+)T淋巴细胞和CD8^(+)T淋巴细胞TIGIT的表达水平呈负相关(P<0.05);CD4^(+)T淋巴细胞、CD8^(+)T淋巴细胞和NK细胞TIGIT的表达水平与估算的肾小球滤过率(eGFR)均呈负相关(P<0.05),与肌酐、胱抑素C呈正相关(P<0.05);CD4^(+)T淋巴细胞、NK细胞TIGIT表达水平与尿素氮呈正相关(P<0.05)。结论CKD患者外周血CD4^(+)T淋巴细胞、CD8^(+)T淋巴细胞和NK细胞TIGIT表达异常,而且TIGIT的表达与CKD分期及免疫系统功能障碍有关。

PD-1敲除及GPC3修饰的嵌合抗原受体T细胞治疗肝癌的实验研究

目的构建程序死亡受体1(PD-1)敲除及磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(GPC3)修饰的嵌合抗原受体T细胞(GPC3-PD1gRNA-CART cells),研究其对肝癌细胞株HepG2的体外杀伤作用,以及其对肝癌动物模型的体内抗肿瘤作用。方法制备GPC3-PD1gRNA-CART细胞,用流式细胞仪检测PD-1、GPC3 CAR的表达情况。体外实验中,设立不同的效靶比(1:1、2:1、4:1),用LDH法测定刀豆蛋白刺激后的GPC3-PD1gRNA-CART细胞体外对HepG2细胞株的杀伤率,检测刀豆蛋白刺激后的GPC3-PD1gRNA-CART细胞和HepG2细胞株共孵育18 h后的细胞培养上清液中IFN-γ的释放水平。设置受刀豆蛋白A刺激的和未受刀豆蛋白A刺激的GPC3修饰的CART细胞(GPC3 CART cells)作为对照组。于重度免疫缺陷小鼠(NDG小鼠)皮下注射HepG2细胞建立肝癌动物模型,观察GPC3-PD1gRNA-CART细胞体内抑瘤作用。实验分为模型组、实验组(GPC3-PD1gRNA-CART组、GPC3 CART组),模型组和实验组通过皮下注射1×10^6个HepG2细胞造模,在肿瘤长径达3 mm后实验组经尾静脉注射5×10^6个GPC3-PD1gRNA-CART细胞或GPC3 CART细胞,模型组经尾静脉注射0.9%NaCl,每周注射1次,共3周,注射体积均为0.2 ml。每隔2天观测肿瘤体积情况,治疗3周后取皮下肿瘤组织,HE染色检测肿瘤组织情况。结果流式细胞术分析结果显示,GPC3 CAR表达率为98.8%。GPC3 CART细胞PD-1的表达率为11.1%,经刀豆蛋白A刺激后,PD-1的表达率上升至92.1%,而GPC3-PD1gRNA-CART细胞的PD-1表达率仅为60%,证实了PD-1有效敲除。当效靶比为1:1、2:1、4:1时,随着效靶比的增加,刀豆蛋白刺激后的GPC3-PD1gRNA-CART细胞对HepG2的杀伤效果和IFN-γ的释放水平也随着效靶比的增加而增加。相同效靶比的情况下,刀豆蛋白A刺激后的GPC3-PD1gRNA-CART细胞对HepG2细胞的杀伤效果显著高于刀豆蛋白A刺激后的GPC3 CART细胞对HepG2细胞的杀伤效果(P<0.05),且刀豆蛋白A刺激后的GPC3-PD1gRNA-CART细胞和HepG2细胞共孵育后IFN-γ的释放水平也显著高于刀豆蛋白A刺激后的GPC3 CART细胞和HepG2细胞共孵育后IFN-γ的释放水平(P<0.05),证明PD-1的敲除可以逆转CART细胞的功能抑制。治疗3周后GPC3-PD1gRNA-CART组抑瘤率为87.30%,与GPC3 CART组(69.03%)和模型组相比均有显著性差异(P<0.05)。肿瘤组织HE染色检测结果显示,相比模型组,实验组肿瘤细胞显著减少,GPC3-PD1gRNA-CART组治疗效果优于GPC3 CART组。结论GPC3-PD1gRNA-CART细胞可解决肿瘤逃逸问题,能于体内外高效靶向杀伤肿瘤细胞,为后续肝癌治疗提供技术基础。