猪源病毒细胞毒性T淋巴细胞表位研究进展

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ类分子,也称为猪白细胞抗原(swine leukocyte antigen,SLA)Ⅰ类分子,在机体抗原递呈、器官移植、细胞免疫应答和调控等方面起重要作用。细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位是抗原经抗原递呈细胞加工后,与SLA-Ⅰ类分子结合并递呈的线性肽段,具有高度特异性,在机体抗原识别递呈和细胞免疫抵抗病毒感染方面发挥着关键作用。CTL表位能够刺激CTLs发挥细胞杀伤作用,主要表现为杀伤病毒。作者将对口蹄疫病毒、非洲猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒等几种重要的猪源病毒的CTL表位研究现状进行综述,并利用生物信息学手段分析SLA-Ⅰ与CTL表位结合基序特征,以期为今后相关猪源病毒CTL表位的研究和多表位疫苗的设计提供参考。

鸡MHC分子限制性禽流感病毒CD8^(+)T细胞表位研究进展

禽流感是威胁家禽养殖业和人类公共卫生安全的重要动物呼吸道疾病。疫苗接种是防控禽流感的有效手段,传统灭活疫苗主要通过诱导体液免疫产生针对病毒表面蛋白的中和抗体来抑制病毒复制。然而,由于病毒抗原表位频繁变异,使得疫苗株与流行株不匹配,且部分禽流感病毒单纯依靠体液免疫无法达到清除性免疫。细胞免疫是抵抗病毒感染的重要免疫反应,MHCⅠ分子递呈病毒T细胞表位是激活CD8^(+)T细胞免疫应答的关键环节,了解鸡MHCⅠ分子递呈的具有免疫活性的CTL表位有助于新型疫苗的设计及其细胞免疫效果评价。目前已鉴定的鸡MHCⅠ递呈禽流感病毒CTL表位数据较少,难以确定关键的免疫显性表位。并且,鸡MHCⅠ分子具有高度多态性,不同类型鸡MHCⅠ分子结构存在细微差异,导致其对病毒抗原有不同的结合偏好,进一步加大了鸡CTL表位的鉴定难度。文章综述了鸡MHC分子特征、MHCⅠ分子对禽流感病毒的重要性、现有T细胞表位研究方法及应用,为鸡MHCⅠ分子限制性T细胞表位的鉴定方法及禽流感表位疫苗的研发设计提供理论依据。

肿瘤抗原细胞毒性T淋巴细胞表位鉴定和多肽疫苗的研究进展

恶性肿瘤是当前威胁人类生命健康的主要疾病之一,尽管手术治疗联合化疗/放疗能够延长患者的生存期,但是这些治疗手段也会损伤正常细胞,产生很多不良反应,再加上很多恶性肿瘤具有侵袭转移和复发等特征,因此,急需发展新的方法来治疗肿瘤患者[1]。

人乳头瘤病毒16E7限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的穿膜肽疫苗设计及体外免疫学研究

目的:利用穿膜肽人免疫缺陷病毒(HIV)-Tat49-57的穿膜能力,设计穿膜肽人乳头瘤病毒(HPV)16E7限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位(第49～57位氨基酸)的融合肽疫苗,并在体外研究其诱导特异性CTL的应答能力。方法:应用多肽固相合成技术,分别合成含HIVTat49-57和人类白细胞抗原(HLA)-A2.1限制性CTL优势表位HPV16E749-57的18肽,和该CTL表位的9肽,并用一无关肽作对照,在体外用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验分别检测了上述18肽和9肽在HLA-A2阳性健康者外周血单个核细胞(PBMC)中诱导的表位E749-57的特异性CTL活性。结果:经质谱分析,上述多肽成功合成,纯度均在95%以上。与9肽相比,18肽能在体外诱导出明显增强的特异性CTL活性(P<0.05)。结论:在HPV16E7HLA-A2.1限制性CTL表位(49～57)的N-末端加上HIV-Tat49-57序列,不会影响表位的提呈效率,而且在体外能有效激发针对E749-57特异性的CTL应答,为新型抗肿瘤及细胞内感染的多肽疫苗设计提供了新思路。

恶性疟细胞毒性T淋巴细胞单表位疫苗抗原递呈细胞模型的建立

目的 构建恶性疟细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）单表位疫苗及建立抗原递呈细胞模型。方法一采用中国人群常见的HLAⅠ类分子A11限制的恶性疟CTL抗原表位（VTCGNGIQVR），合成其DNA序列并克隆于真核表达载体，构建CTL单表位DNA疫苗。将上述克隆在HLA-A11表型细胞株中进行表达，流式细胞仪检测细胞表面HLAⅠ类分子表达水平。结果 上述CTL单表位DNA疫苗编码的短肽在细胞内的表达明显促进HLA-A11分子在细胞表面的表达，用流式细胞仪测定平均荧光强度可量化表达水平(P ＜ 0．05)。结论 成功构建CTL单表位短肽表达载体，模拟体内环境建立了抗原递呈细胞模型，提示CTL表位在该细胞模型内被内源性加工和递呈，以该表位为基础的疫苗可以为HLA-A11遗传背景的人群提供免疫防护。

妊娠期特异性beta1糖蛋白9 HLA-A3限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的鉴定

目的:鉴定来自食管癌细胞中特异性高表达的妊娠期特异性beta1糖蛋白9(PSG9)的HLA-A3限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。方法:首先运用RT-PCR方法检测PSG9mRNA在食管癌细胞EC9706、EC-1及EC-109中的表达情况。然后通过Bimas和Syfpeithi预测,再结合NetCTL1.2选取4条来源于PSG9的HLA-A3限制性的表位。候选表位P336的2位的氨基酸由异亮氨酸替换为亮氨酸,9位的氨基酸由酪氨酸替换为赖氨酸。候选表位P378的9位氨基酸由精氨酸替换为赖氨酸。候选表位通过标准的Fmoc化学法合成,通过结合力实验检测表位与T2A3细胞表面HLA-A3分子的结合力水平,通过细胞毒实验检测对EC-1细胞毒活性。结果:PSG9在肿瘤细胞EC9706、EC-1以及EC-109中都有表达。候选表位P107、P201和P336-2L9K与HLA-A3分子有弱结合力,P336、P378和P378-9K与HLA-A3分子有中等结合力。细胞毒实验结果显示P336-2L9K、P378和P378-9K对EC-1细胞均有一定的杀伤作用。结论:多肽P336-2L9K、P378和P378-9K能诱导体外抗肿瘤免疫反应,有可能成为PSG9阳性肿瘤细胞的共同CTL表位。

GPC3特异性HLA-A11限制的T淋巴细胞表位肽免疫活性检测

目的设计合成人类白细胞抗原(HLA)-A11限制性T细胞识别的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)多肽,并检测其免疫原性和反应性。方法利用BIMAS和SYFPEITHI评分系统评价GPC3多肽与HLA-A11分子的结合能力,预测出相应的抗原谱,合成HLA-A1101限制性GPC3多肽库;流式细胞仪检测HCC患者HLA-A11分子的表达;多肽刺激外周血淋巴细胞,酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测T细胞对GPC3多肽的反应性。结果流式细胞仪检测32例HCC患者,7例HLA-A11分子表达阳性(21.9%);ELISPOT检测发现17例(53.1%)HCC患者的T细胞应答阳性,7例(21.9%)HLA-A11表型检测阳性的HCC患者,T细胞应答结果成强阳性。HLA-A11限制性GPC3多肽应答率符合人群中相应基因位点的自然表达率。结论 GPC3多肽设计合理,具有良好的免疫原性和反应性。

融合表达淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒和卵清白蛋白CD8^+T细胞表位的减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建与鉴定

依据淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)主要保护性抗原CD8+T细胞表位VRRPQASGVYMGNLTAQ和卵清白蛋白(OVA)CD8+T细胞表位SIINFEKL,设计、合成两条编码LCMV和OVACD8+T细胞表位的寡核苷酸片段,经退火后,克隆入绿色荧光蛋白表达质粒pYAGFP,经PCR扩增和序列测定分析,证实成功构建T细胞表位与绿色荧光蛋白融合表达的重组质粒pYAGFPL＿O,将此重组质粒pYAGFPL＿O转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550,获得重组沙门氏菌X4550(pYAGF PL＿O)。用SDS＿PAGE电泳测得重组菌表达的融合蛋白约为30kD。同时,荧光显微镜下观察到X4550(pYAGFPL＿O)发出黄绿色荧光。这些结果表明LCMV和OVAT细胞表位已成功表达。重组菌X4550(pYAGFPL＿O)的获得为研究沙门氏菌载体携带外源抗原的T细胞应答规律及调控机理打下了重要基础。

猪圆环病毒2型ORF1和ORF3T淋巴细胞抗原表位的克隆与原核表达

根据Stevenson筛选出来的3个具有活性的T淋巴细胞抗原表位(T lymphocyte epitope,TCE)合成tce基因(180 bp),成功插入到pMD18-T Simple载体中,筛选获得重组质粒,命名为pMD-TCE.将tce酶切产物亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒,命名为pET-TCE.用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE检测,结果显示合成基因在pET-32a(+)中获得了高效融合表达,其表达蛋白相对分子质量约为25 000,Western-blot分析结果表明,获得的融合蛋白可与猪圆环病毒2型(PCV2)阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫原性.

原发性肝癌高表达抗原GPC-3的HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞表位预测

目的预测原发性肝癌高表达抗原GPC-3的HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。方法通过国家生物技术信息中心(NCBI)数据库获取GPC-3蛋白的氨基酸序列,利用超基序、量化基序法和NetCTL数据库预测分析GPC-3的HLA-A2限制性CTL表位。结果初步筛选出GPC-3肿瘤抗原的HLA-A2限制性CTL优势表位,分别为GPC-3 102～110,155～163,169～177,229～237,281～289,319～327,326～334,367～375,522～530,564～572。结论预测出GPC-3的HLA-A2限制性CTL表位为GPC-3阳性原发性肝癌免疫靶向治疗奠定了基础。

HPV18 E7抗原T细胞表位的鉴定及CD4^+T淋巴细胞的免疫反应

目的初步鉴定人乳头瘤病毒(HPV)18型E7抗原的辅助T淋巴细胞(Th)表位及CD4^+T淋巴细胞的免疫反应。方法以免疫磁珠进一步分离HLA-DRB1~*0301阳性健康人外周血单核细胞(PBMC)中的CD4~T淋巴细胞,流式细胞仪鉴定细胞纯度,用之前实验中已获得的3个HPV18 E7抗原HLA-DRB1~*0301限制性Th表位刺激外周血CD4~T淋巴细胞,用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测CD4~T淋巴细胞增殖活性。ELISA方法分析表位刺激CD4~T淋巴细胞分泌的细胞因子。结果多肽P1(HPV18E780-94)在体外刺激CD4^+T淋巴细胞后能够有效诱导CD4~T淋巴细胞增殖,P1组与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<O.01),多肽P1(HPV18 E780-94)刺激CD4^+T淋巴细胞分泌IFN-γ,P1组与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论 P1(HPV18 E780-94)可能为HPV18 E7抗原HLA-DRB1~*0301限制性Th表位。

实验性肺炎球菌荚膜多糖-辅助性T淋巴细胞表位结合疫苗的研制

为了讨论小分子合成肽能否替代大分子细菌蛋白用于疫苗制备,美国Epimmune公司Alexander等将含13个氨基酸的全人白细胞抗原(HLA)-同向重复(DR)表位(PADRE)与肺炎球菌荚膜多糖(PS)结合制成糖结合疫苗(PADRE-PS),评估了PADRE作为糖结合疫苗蛋白载体的可能性.

羊口疮病毒114蛋白的优势抗原表位预测及ORFV多表位疫苗的构建

为了探究羊口疮病毒114蛋白作为羊口疮病毒多表位疫苗靶标的可能性,试验利用在线软件ABCpred预测114蛋白的优势B细胞表位,利用在线软件IEDB的MHC-Ⅰbinding server预测114蛋白的优势细胞毒性T细胞(CTL)表位;利用IEDB的MHC-Ⅱbinding server预测114蛋白的优势辅助性T细胞(HTL)表位;使用柔性短肽接头连接114蛋白的优势B、T细胞抗原表位,构建羊口疮病毒多表位疫苗。结果:羊口疮病毒114蛋白由346个氨基酸组成,包含12个优势B细胞抗原表位,分别位于292~307 aa、264~279 aa、146~161 aa、331~346 aa、113~128 aa、298~313 aa、35~50 aa、324~339 aa、281~296 aa、162~177 aa、315~330 aa、204~219 aa;包含1个优势CTL抗原表位,位于65~73 aa;包含5个优势HTL抗原表位,分别位于69~83 aa、68~82 aa、70~84 aa、48~62 aa、284~298 aa;构建了基于114蛋白的优势抗原表位的羊口疮病毒多表位疫苗。结论:羊口疮病毒114蛋白包含多个优势B细胞和T细胞抗原表位,可作为羊口疮病毒多表位疫苗的候选靶标,具有诱导强烈体液免疫与细胞免疫反应的可能性。

中国人丙型肝炎病毒复合细胞毒性T淋巴细胞多表位基因真核载体的构建及在COS-7细胞中的表达

目的构建中国人丙型肝炎病毒(HCV)复合细胞毒性T淋巴细胞(CTL)多表位基因的真核表达载体,并观察其在真核细胞中的表达。方法根据生物信息学方法筛选中国人的HCV多个CTL优势表位,合成复合多表位抗原基因(mcf);将其克隆入真核表达载体pEGFP-N1,转染COS-7细胞,在荧光显微镜下观察mcf-EGFP融合蛋白在细胞中的分布和定位,RT-PCR及Western blot检测其mRNA及蛋白表达。结果成功构建了真核表达载体pEGFP-mcf。将构建的真核表达载体pEGFP-mcf转染COS-7细胞后,绿色荧光分布于COS-7细胞胞质中;而转染空载体pEGFP-N1后,绿色荧光弥散分布于COS-7细胞胞核及胞质中。RT-PCR检测到转染细胞中mcfmRNA表达;West-ern blot结果证明合成mcf可在COS-7细胞中表达。结论该真核表达载体的成功表达及鉴定,为下一步中国人的HCV复合CTL多表位疫苗的研究奠定了基础。

GPC3抗原表位肽致敏树突状细胞对T淋巴细胞活化的影响

目的探讨磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)抗原表位肽致敏的树突状细胞(DC)对T淋巴细胞活化的影响。方法选用基因型人类白细胞抗原A2阳性的剖宫产妇的胎盘端脐带血50 m L,分离培养DC及T细胞,用人工合成的GPC3抗原表位肽(GPC3_(144-152)、GPC3_(298-306))、冻融Hep G2细胞抗原致敏DC (DC-GPC3_(144-152)组、DCGPC3_(298-306)组、DC-HepG2组、DC组),经致敏DC处理的T细胞随机分为DC-GPC3_(144-152)-T组、DC-GPC3_(298-306)-T组、DC-HepG2-T组、DC-T组,以未经活化的T细胞作对照(T细胞组)。用流式细胞术检测DC表型、T细胞分类及表面趋化因子的表达。结果 GPC3_(144-152)、GPC3_(298-306)抗原表位肽和冻融Hep G2细胞抗原三种致敏方式均能诱导DC呈典型成熟DC的形态,表面均高表达CD83、CD80和CD86抗原,且不同致敏方式之间CD8^+T、CD4^+T淋巴细胞比例差异无统计学意义(P均> 0. 05);与T细胞组比较,GPC3_(144-152)-T组和DC-GPC3_(298-306)-T组CD4+T细胞中Th1细胞比例高(P均<0. 05);与DC-T组比较,DC-GPC3_(144-152)-T组、DC-GPC3_(298-306)-T组、DC-HepG2-T组CCR6表达高(P均<0. 05)。结论 GPC3_(144-152)和GPC3_(298-306)表位抗原肽均能够有效致敏DC,并促进与DC共培养的T淋巴细胞活化。

一种基于独特的B淋巴细胞表位的新型疫苗对小鼠HBsAg的抑制作用

【据《Gut》2019年3月报道】题:一种基于独特的B淋巴细胞表位的新型疫苗对小鼠HBsAg的抑制作用(作者ZhangTY等)本研究旨在开发一种基于独特B淋巴细胞表位的新型疫苗,并探讨其对慢性乙型肝炎动物模型的治疗作用。对HBV耐受的小鼠进行一系列肽和载体蛋白的检测,获得一种优化的治疗分子。来自厦门公共卫生学院、生命科学学院分子疫苗学与分子诊断学国家重点实验室的Zhang等系统地研究了该候选药物的免疫原性、治疗效果及作用机制。

丙型肝炎病毒多CTL表位树突状细胞疫苗的构建及体外刺激T细胞应答

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)多细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位树突状细胞(DC)疫苗,观察其体外刺激的T细胞反应,为下一步做体内免疫实验提供一定的资料。方法构建和制备出含绿色荧光蛋白(GFP)标签的HCV两个CTL表位的重组腺病毒,感染DC,直接在荧光显微镜下或用流式细胞仪检测其感染率;RT-PCR和Western Blot方法检测HCV多CTL表位的表达。流式细胞术分析感染前后DC的CD80、CD83、CD86和人类白细胞抗原(HLA)-DR的表达,CCK-8法观察感染重组腺病毒的DC促进T细胞的增殖效应。ELISA检测重组腺病毒刺激后的DC培养上清液内白细胞介素(IL)-12及DC和T细胞混合培养上清液内干扰素(IFN)-γ的含量。用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测特异性CTL的杀伤活性。结果成功构建含GFP标签的HCV多CTL表位的重组腺病毒,并在DC中表达。重组腺病毒能促进DC成熟,DC的CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达分别为(71.19±3.29)%、(81.21±5.07)%、(91.23±4.24)%、(97.95±5.31)%。感染DC后促进同源T细胞增殖,DC:T为1:10时增殖指数为6.806±0.247。分泌的IL-12和IFN-γ也明显增多,分别达到(193.83±6.25)pg/ml和(111.14±2.09)pg/ml。感染DC刺激的CTL能特异性杀伤转染FL-J6/JFH的Huh-7.5细胞,当效靶比为100:1时,AD1-DC-L的杀伤率为35.99%。结论重组多CTL表位腺病毒在体外能有效感染DC,促进了T细胞反应,为下一步抗HCV的DC疫苗研制打下基础。

经MHCⅡ通路的屋尘螨1类变应原T细胞表位融合肽疫苗载体的构建与表达

目的构建经MHCⅡ通路的屋尘螨1类变应原Der p 1的T细胞表位肽疫苗重组载体。方法分别合成TAT、Ih C和含编码Der p 1的3段T细胞表位的融合核苷酸序列,用特异性引物PCR扩增相应的基因片段,分别用相应的双酶切后,用T4 DNA连接酶连接形成TAT-Ih C-Der p 1-3T融合基因,并插入至原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组原核表达载体p ET-28a(+)-TATIh C-Der p 1-3T,Bam HⅠ和XhoⅠ进行双酶切和测序鉴定。重组载体转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌株,IPTG诱导后,经SDS-PAGE电泳分析和Western blot验证,纯化TAT-Ih C-Der p 1-3T蛋白后进行Ig E结合试验。结果双酶切和测序结果表明,成功构建了p ET-28a-TAT-Ih C-Der p 1-3T重组原核表达载体;SDS-PAGE电泳分析显示TAT-Ih C-Der p 1-3T可诱导表达;Western blot检测表明该融合蛋白纯化成功;Ig E结合试验表明TAT-Ih C-Der p 1-3T结合屋尘螨过敏病人血清Ig E的能力强于Der p 1变应原(P<0.001)。结论成功构建了可表达经MHC通路的编码Der p 1的3段T细胞表位的重组p ET-28a-TAT-Ih C-Der p 1-3T载体,纯化的TAT-Ih C-Der p 1-3T具有较强的Ig E结合能力,从而为后续经MHC通路的特异性免疫治疗奠定基础。

辅助T细胞表位预测及其在抗寄生虫疫苗研发中的应用

细胞免疫在防御外来病原感染、自身免疫及肿瘤等疾病中发挥重要作用。随着分子免疫学研究的不断发展,对T淋巴细胞免疫分子机制的阐释,大量T细胞表位信息以及功能基因组学资料的积累,使得基于数据驱动的预测T细胞表位的研究受到重视,可能成为疫苗研发的重要工具之一。本文概述辅助T细胞表位预测的理论和方法及其在寄生虫疫苗研发中的应用,并讨论未来的研究方向。

用辅助性T细胞表位增强猪带绦虫DNA疫苗的免疫保护反应

在猪绦虫融合抗原 pCC2 7(本室从六钩蚴cDNA表达文库筛选的 3个保护性抗原经拼接所得 )基因片段 5′末端引入 1个通用型辅助性T淋巴细胞表位、2个谷胱甘肽还原酶的辅助性T淋巴细胞表位 (TGG) ,构建成DNA疫苗。通过肌肉注射途径将这种DNA疫苗免疫小鼠和仔猪。动物试验结果表明 ,TGG表位可提高小鼠血清 pCC2 7抗体IgG、IgG1、IgG2a的水平 ,且长时间保持较高应答水平。用该疫苗免疫仔猪获得了 89%的保护率。