杨梅黄酮通过激活miR-361-3p/NFAT5通路改善大鼠急性肺损伤

目的:探讨杨梅黄酮对大鼠急性肺损伤的保护作用及机制。方法:采用脂多糖腹腔注射建立大鼠急性肺损伤(acute lung injury,ALI)模型,雄性SD大鼠50只随机分为5组(n=10):正常对照组、ALI模型组、低剂量杨梅黄酮组、中剂量杨梅黄酮组和高剂量杨梅黄酮组。检测肺损伤指标:肺泡灌洗液(BALF)总蛋白浓度、肺湿/干重比值、苏木素伊红染色;检测肺部炎性反应指标:BALF中炎性因子白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量、髓过氧化物酶(MPO)活性及细胞计数;检测信号机制分子:肺组织miR-361-3p和活化性T淋巴细胞核因子5(NFAT5)表达量。另培养的A549细胞随机分为8组:对照组、脂多糖组、低剂量杨梅黄酮组、中剂量杨梅黄酮组、高剂量杨梅黄酮组、miR转染空白对照(miR-NC)组、miR-361-3p拟似物(miR-361-3p mimic)组和KRN2(NFAT5抑制剂)组。TUNEL免疫荧光技术检测A549细胞凋亡率;检测A549细胞中凋亡相关蛋白Bax表达量及培养液中IL-6和TNF-α含量。结果:与正常对照组比较,ALI模型组肺湿/干重比值增大,BALF中总蛋白浓度升高,细胞计数增大,IL-6和TNF-α含量升高,肺组织MPO活性升高,NFAT5表达量增多,而肺组织miR-361-3p表达量减少。与ALI模型组比较,中、高剂量杨梅黄酮治疗明显降低肺湿/干重比值,降低BALF中总蛋白浓度,减小细胞计数,减少IL-6和TNF-α含量,降低肺组织MPO活性,减少NFAT5表达量,升高肺组织miR-361-3p表达量。机制上,应用miR-361-3p拟似物预处理可降低A549细胞中NFAT5表达量;中、高剂量杨梅黄酮、miR-361-3p拟似物和NFAT5抑制剂KRN2均明显减轻A549细胞凋亡和减少炎性因子释放。结论:杨梅黄酮通过调控炎症相关miR-361-3p/NFAT5信号轴而改善急性肺损伤,为杨梅黄酮在急性肺损伤临床治疗中的应用提供实验依据。

NFAT5基因报告载体的构建及其与miR-155关系的实验研究

目的通过生物信息软件预测出miR-155的靶基因,构建miR-155靶基因荧光素酶基因报告载体,验证其与miR-155的对应关系。方法以数据库miR Base为依据,对miR-155进行生物信息学分析,通过Target Scan、Mir Base、Pic Tar三大软件预测miR-155的靶基因;将设计合成的T淋巴细胞核因子5(NFAT5)及其突变序列NFAT5-mu序列分别克隆至荧光素酶报告质粒pMIR-REPORT^(TM) Luciferace;将第4代人胚胎肾293AD(HEK-293AD)细胞按随机数字表法分为4组:miR-155mimics+pMIR-NFAT5组、miR-155 mimics+pMIR-NFAT5-mu组、miR-155inhibitor+pMIR-NFAT5组、miR155 Negative control+pMIR-NFAT5组与对照质粒(pRL-TK)共转染24h后用双荧光素酶检测试剂盒测定相对荧光素酶活性。结果 Mirbase、TargetScan、PicTar预测交叉结果显示,NFAT5基因3′UTR与miR-155存在结合互补位点;构建pMIR-NFAT5、pMIR-NFAT5-mu重组质粒经酶切及测序鉴定正确;双荧光素酶报告基因检测系统显示:pMIR-NFAT5+miR155 mimics组较pMIR-NFAT5+miR-control组荧光素酶活性降低,差异有统计学意义(P<0.01);而其他组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建pMIR-NFAT5、pMIR-NFAT5-mu荧光素酶报告基因重组质粒;证实miR-155对NFAT5基因mRNA 3′-UTR具有靶向调控作用,为下一步研究miR-155在吸入性肺损伤机制中的作用提供前期实验室数据和方法。