初诊急性髓系白血病患者T细胞免疫球蛋白黏液素3和程序性死亡分子1的表达及临床意义

目的探索初诊急性髓系白血病患者T细胞免疫球蛋白黏液素3(Tim-3)和程序性死亡分子1(PD-1)的表达水平及其临床意义。方法回顾性选取2018年7月至2020年4月在聊城市第二人民医院住院及门诊初诊的34例急性髓系白血病患者和20例良性血液病患者作为研究对象,根据不同疾病分为观察组(急性髓系白血病,34例)和对照组(良性血液病,20例)。应用流式细胞术分别检测外周血CD3+T细胞Tim-3和细胞程序性死亡-配体1(PD-L1)的表达水平,以及应用实时荧光定量PCR检测骨髓Tim-3 mRNA和PD-L1 mRNA的相对表达量,并进行对比分析。结果观察组患者的外周血CD3+细胞Tim-3的表达、骨髓Tim-3 mRNA均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001);观察组患者的外周血CD3+细胞PD-L1的表达、骨髓PD-L1 mRNA均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。结论初诊急性髓系白血病患者Tim-3和PD-L1表达水平升高,在急性髓系白血病免疫抑制微环境的形成中起到了一定作用。

人外周血TIM3基因敲除T淋巴细胞的制备及其抗肿瘤作用

目的:通过CRISPR-Cas9基因编辑技术及质粒电转染技术制备T细胞免疫球蛋白黏液素3(TIM3)基因敲除的人外周血T淋巴细胞,探讨敲除TIM3基因后能否增强T细胞免疫功能及其抗肿瘤作用。方法:通过电转染法将hTIM3 sgRNA/Cas9双质粒共转染EBV阳性胃癌患者外周血T淋巴细胞,电转24 h后流式细胞术检测转染效率并利用荧光显微镜观察;体外培养过程中观察基因敲除后T细胞增殖活性,流式细胞术验证TIM3基因敲除效率以及细胞表型的变化。用肿瘤抗原肽活化T细胞检测TIM3基因敲除后T细胞分泌细胞因子水平及体外杀伤胃癌AGS-EBV细胞的能力。结果:电转染法能够有效地将hTIM3 sgRNA/Cas9双质粒敲除体系转入人外周血T淋巴细胞,其转染效率平均达(41.5±3.6)%,基因敲除效率波动在40.0%～50.0%(均P<0.01);经抗原活化后的基因敲除组T细胞的增殖活性和免疫表型未见明显变化,表面活化分子中仅见HLA-DR较对照组明显提高(P<0.05);TIM3基因敲除T细胞分泌TNF-α、IFN-γ的水平显著增高(P<0.01或P<0.05),体外杀伤胃癌AGS-EBV细胞的能力也明显增强(均P<0.05)。结论:用CRISPR-Cas9基因编辑及质粒电转染技术制备人外周血TIM3基因敲除T淋巴细胞的方法简易可行,在体外的扩增活化中保持TIM3基因水平下调并具有更高的免疫应答水平以及更强的抗肿瘤作用。这一新技术的研发为基因工程化细胞免疫治疗提供了新的思路。

不同刺激剂对淋巴细胞中PD-1与TIM3蛋白表达的影响

目的研究不同刺激剂对人外周血淋巴细胞中PD-1与TIM3蛋白表达的影响。方法采用密度离心法分离人外周血淋巴细胞,并通过Western blot检测在抗CD3/CD28抗体、PHA、SEB、Con A4种不同刺激剂下人外周血淋巴细胞PD-1与TIM3总蛋白的变化情况,并通过流式细胞技术检测4种刺激条件下T淋巴细胞及其CD3^+CD4^+、CD3^+CD8^+亚群膜表面的PD-1与TIM3的改变。结果 Western blot结果显示,4种刺激剂均能刺激总的PD-1蛋白的表达,减少总TIM3蛋白的表达。流式细胞分析仪结果显示,在4种刺激剂作用下,人外周血T淋巴细胞表面及其CD3^+CD4^+、CD3^+CD8^+T细胞亚群膜表面的PD-1与TIM3蛋白表达均呈现升高趋势。结论 4种常见刺激剂均可诱导总PD-1蛋白和细胞膜上PD-1蛋白的表达,降低TIM3总蛋白的表达以及诱导淋巴细胞表面TIM3蛋白的表达。其中PHA较其他3种刺激剂展现出较好的剂量关系。

外周血Tim3,IL-32,PD-1/PD-L1用于沙利度胺联合达那唑治疗骨髓增生异常综合征疗效评估价值分析

目的探讨沙利度胺联合达那唑治疗骨髓增生异常综合征(MDS)疗效的评估指标。方法选取医院2018年1月至2020年5月收治的MDS患者112例,均予沙利度胺片联合达那唑胶囊口服治疗3个月,根据疗效分为有效组(91例)和无效组(21例)。比较两组患者的白细胞计数(WBC)、血红蛋白(Hb)、血小板计数(PLT)、骨髓原始细胞比例及T淋巴细胞免疫球蛋白黏液素3(Tim3)、白细胞介素32(IL-32)、程序性死亡因子-1/程序性死亡因子配体-1(PD-1/PD-L1)水平。采用Pearson相关性分析预测治疗前后外周血Tim3,IL-32,PD-1/PD-L1之间及其分别与WBC,Hb,PLT和骨髓原始细胞比例间的相关性,评价上述外周血指标对该治疗方案疗效的评估价值。结果与无效组比较,有效组患者治疗后的WBC,Hb,PLT均显著升高,骨髓原始细胞比例显著降低(P<0.05),且外周血Tim3,IL-32,PD-1/PD-L1水平均显著降低(P<0.05)。治疗前后,患者外周血Tim3分别与IL-32,PD-1/PD-L1水平呈显著正相关,IL-32与PD-1/PD-L1水平呈显著正相关,外周血Tim3,IL-32,PD-1/PD-L1水平分别与WBC,Hb,PLT水平呈显著负相关,与骨髓原始细胞比例呈显著正相关,外周血Tim3,IL-32,PD-1/PD-L1水平与沙利度胺联合达那唑治疗MDS的疗效显著相关(P<0.05)。外周血Tim 3,IL-32,PD-1/PD-L1联合评估两药联用治疗MDS可能无效的药-时曲线下面积(0.885)相对三者单一评估时更大,敏感度、特异度分别为76.19%,92.31%。结论沙利度胺联合达那唑治疗MDS,可有效下调外周血Tim3,IL-32,PD-1/PD-L1水平,综合分析3个指标有助于评价沙利度胺联合达那唑治疗MDS的疗效。

Tim-3在诱导免疫耐受中的研究进展

T细胞免疫球蛋白黏液素3(T cell immunoglobulin mucin 3,Tim-3)可表达于Th1细胞,还可表达在其他免疫细胞及非免疫细胞。Tim-3能抑制T细胞介导的免疫反应,诱导免疫耐受。其可与多种配体结合,并在多种疾病的发生、发展中发挥着重要的调控作用。就近年来Tim-3在免疫反应中的作用机制作一综述,以期进一步认识Tim-3在诱导免疫耐受中的作用和潜在的治疗价值。

PD-1及TIM-3在早期宫颈癌患者中的表达及与生存预后的关系研究

目的探讨程序性死亡受体1(PD-1)、T细胞免疫球蛋白黏液素3(TIM-3)在早期宫颈癌组织中的表达情况及二者与宫颈癌临床病理特征的关系,为宫颈癌免疫治疗、监测进展和预后提供新的思路。方法收集2016年1月1日—6月30日在河北省人民医院初治的45例早期宫颈癌患者术后病理标本及临床资料,采用免疫组化法检测宫颈癌组织中PD-1及TIM-3的表达情况。按照PD-1和TIM-3表达情况分为PD-1阳性组、PD-1阴性组、TIM-3阳性组、TIM-3阴性组,比较各组临床病理特征及随访1~4年的生存率,采用log-rank检验进行预后单因素分析;单因素分析有意义的变量进行COX风险比例回归模型预后多因素分析;Pearson分析PD-1和TIM-3的相关性及各因素与二者的相关性。结果宫颈癌组织中PD-1蛋白阳性表达率为73.3%(33/45),TIM-3蛋白阳性表达率为64.4%(29/45)。TIM-3阳性组和TIM-3阴性组比较、PD-1阳性组与PD-1阴性组比较,肿瘤分化程度、是否发生淋巴结转移差异均有统计学意义(P均<0.05)。log-rank检验,PD-1阴性组的中位无病生存期、中位随访生存时间均明显长于PD-1阳性组(P=0.0484,P=0.0450),TIM-3阴性组的中位无病生存期、中位随访生存时间均明显长于TIM-3阳性组(P=0.0160,P=0.0166)。单因素分析显示患者的肿瘤分化程度、是否发生淋巴结转移、PD-1和TIM-3阳性表达情况与患者的无病生存期和随访生存时间均有明显相关性(P均<0.05),且与患者的年龄、随访生存时间有明显相关性(P均<0.05)。多因素分析显示,肿瘤分化程度是患者无病生存期和随访生存时间的独立影响因素(P=0.029,P=0.047)。相关性分析显示,PD-1和TIM-3的表达呈正相关(r=0.497,P=0.001),PD-1和TIM-3与肿瘤分化程度均呈正相关(r=0.400,P=0.006;r=0.396,P=0.007),与是否淋巴结转移均呈负相关(r=-0.312,P=0.037;r=-0.035,P=0.017)。结论早期宫颈癌患者PD-1和TIM-3阳性表达率较高,PD-1和TIM-3的过表达可能预示着易发生复发转移和较差的生存结局。

T细胞免疫球蛋白黏液素3基因在急性白血病中的表达及其临床意义

目的 探讨T细胞免疫球蛋白黏液素3（Tim-3）基因在急性白血病患者和白血病细胞株中的表达情况,并分析其临床意义.方法 收集初治急性白血病患者65例和8株白血病细胞株,同时收集15名健康供体的骨髓作为健康对照,分离单个核细胞,提取DNA,应用实时荧光定量聚合酶链反应检测单个核细胞上Tim-3 mRNA相对表达量,比较不同类型白血病Tim-3 mRNA表达差异,分析急性白血病患者Tim-3 mRNA表达与临床特征的关系.结果 M3细胞株NB4及非M3细胞株Kasumi-1、HL60、SHI-1、THP-1、Jurkat、CCRF-CEM、Mutz-1 Tim-3 mRNA相对表达量分别为（4.51±0.62）×10-5、（79.22±2.91）×10-5、（41.14±3.01）×10-5、（27.70±3.50）×10-5、（60.47±4.97）×10-5、（10.44±1.77）×10-5、（42.80±2.95）×10-5、（11.68±1.96）×10-5.非M3细胞株Tim-3 mRNA表达水平均高于NB4细胞株（均P＜0.05）.非M3型急性髓系白血病（AML）患者Tim-3 mRNA相对表达量为（27.64±13.35）×10-4,AML-M3患者为（4.81±2.30）×10-4,急性淋巴细胞白血病（ALL）为（32.09±23.42）×10-4.其在非M3型AML和ALL中的表达水平高于健康对照[（12.02±4.22）×10-4],差异有统计学意义（P＜0.05）,非M3型AML和ALL患者的Tim-3 mRNA表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）.在非M3型AML中,根据法、美、英协作组（FAB）分型,Tim-3 mRNA在AML-M4中的表达水平高于其他类型AML（P＜0.05）.不同性别、年龄、骨髓原始细胞数、初诊白细胞数的急性白血病患者间Tim-3 mRNA表达水平差异均无统计学意义（均P＞0.05）.结论 Tim-3 mRNA高表达于非M3型的急性白血病患者和细胞株,其表达水平与初治急性白血病患者的性别、年龄和原始细胞数无关.

骨髓增生异常综合征患者骨髓TIM-3表达水平及意义分析

目的分析骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓T细胞免疫球蛋白黏液素3(TIM-3)表达水平及其意义。方法收集75例MDS患者及20例非MDS骨髓,应用流式细胞术测定骨髓TIM-3+干细胞(CD34+CD38-Lin-TIM-3+细胞群)数量,分析MDS患者TIM-3表达情况与患者染色体核型、病情严重程度、MDS亚型、转白率及预后的关系。结果MDS患者骨髓液CD34+CD38-Lin-TIM-3+细胞比例高于非MDS(P<0.05);不同染色体核型、不同预后评分、不同MDS亚型MDS患者骨髓TIM-3表达比较差异有统计学意义(P<0.05),随核型变差、预后评分上升、亚型进展TIM-3表达水平上升(P<0.05);MDS转白患者骨髓TIM-3表达情况高于未转白组,随访死亡组骨髓TIM-3表达高于生存组(P<0.05)。结论MDS患者骨髓造血干细胞TIM-3表达率较高,且与MDS染色体核型、病情严重程度、亚型、转白率及预后密切相关,系白血病前状态重要因子,参与MDS病情进展过程。

Tim3在再生障碍性贫血和骨髓增生异常综合征鉴别诊断中的意义

目的:探究T细胞免疫球蛋白黏液素(T cell immunoglobulin and mucin,Tim)3在再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)和骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)鉴别诊断中的意义。方法:流式细胞术检测24例AA患者、20例MDS患者和17例健康对照者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中CD4^+Tim1^+和CD4^+Tim3^+细胞比例。实时荧光定量PCR检测AA、MDS患者和健康对照者PBMC中Tim3 m RNA和S型凝集素半乳糖凝集素9(galectin-9,Gal-9)mRNA表达水平。结果:健康对照者、AA和MDS患者PBMC中CD4^+Tim1^+细胞比例差异无统计学意义;MDS患者的CD4^+Tim3^+细胞比例明显高于AA患者和健康对照者(P<0.05);高危组MDS患者CD4^+Tim3^+细胞比例明显高于低中危组MDS患者(P<0.01)和健康对照者(P<0.05);健康对照者、AA和MDS患者的Tim3 m RNA和Gal-9 mRNA水平差异无统计学意义。结论:MDS患者Tim3表达水平明显高于AA患者,并与疾病危险度有关,提示Tim3可能参与MDS的发病,并可能成为临床鉴别AA与MDS的标志物。

骨髓增生异常综合征血清TIM-3、IL-10的表达及其与病情程度及临床预后的关系

目的分析血清T细胞免疫球蛋白黏液素3(T cell immnoglobulin and mucin 3,TIM-3)、白细胞介素-10(interleukin,IL-10)在骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)患者中表达,并验证2项指标与患者病情程度及临床预后的关系。方法回顾性分析2016年7月-2021年7月收治的100例MDS患者临床资料。根据患者病情程度[参照骨髓增生异常综合征国际预后评分系统(IPSS)、WHO的预后积分系统(WPSS)、修订的IPSS(IPSS-R)评定]分为相对低危组和相对高危组。同时查阅及统计患者基线资料、血清TIM-3、IL-10水平。比较2组患者血清TIM-3、IL-10水平。根据IPSS、WPSS及IPSS-R分期对治疗前血清TIM-3、IL-10水平绘制受试者工作特征曲线图分析,根据最佳截断值分为TIM-3与IL-10高表达组和低表达组;比较不同血清TIM-3、IL-10表达情况的MDS患者基线资料及IPSS、WPSS及IPSS-R评分情况。同时查阅患者随访1年(截至2022年7月)的结果,比较不同TIM-3、IL-10表达情况的MDS患者生存情况。结果100例患者中相对低危组38例,相对高危组62例;相对高危组血清TIM-3、IL-10水平均高于相对低危组(P<0.05)。按TIM-3为1.680 ng/mL分组,TIM-3高表达组50例,TIM-3低表达组50例;按IL-10为119.075 pg/mL分组,IL-10高表达组54例,IL-10低表达组46例。不同血清TIM-3、IL-10水平患者性别、年龄、FAB分型情况及治疗前白细胞、血小板、血红蛋白水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。TIM-3高表达组IPSS、WPSS及IPSS-R评分高危占比均高于TIM-3低表达组,IL-10高表达组IPSS、WPSS及IPSS-R评分高危占比均高于IL-10低表达组(P<0.05)。血清TIM-3高表达的MDS患者1年生存时间(10.68±0.42)个月,明显低于低表达患者(11.94±0.04)个月(χ^(2)=5.192,P=0.023)。IL-10高表达的MDS患者1年生存时间(10.89±0.37)个月,明显低于低表达患者(11.80±0.17)个月(χ^(2)=3.888,P=0.049)。结论血清TIM-3、IL-10在MDS患者中表达存在一定的差异性,其中TIM-3高表达与IL-10高表达提示患者病情较重、预后较差。