基因熔解曲线谱型图技术分析肺结核患者CD4^+T细胞受体β链可变区基因多态性

目的利用荧光定量PCR结合基因熔解曲线谱型图(gene melting curve spectratyping,GMCS)技术分析肺结核病患者外周血CD4+T细胞中T细胞受体(TCR)β链可变区(BV)基因多态性。方法提取15例健康人和30例肺结核患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中的总RNA,反转录成cDNA,以26个人TCRBV基因家族设计上游引物,共同的TCRβ链恒定区(BC)基因设计下游引物,荧光定量PCR扩增26个TCRBV基因家族谱系,样品谱系用荧光定量PCR中的DNA熔解曲线进行分析。结果在15例健康人外周血T细胞TCRβ链中,同一BV位点PCR产物的熔解曲线谱型相同。但是与健康人相比,30例肺结核患者的外周血TCRβ链26个BV位点熔解曲线谱型存在差异,差异比率为6.7%~33.3%,差异具有显著性(P<0.05,P<0.01)。此外,26个位点中有13个位点熔解曲线谱型差异比率≥20%。结论荧光定量PCR结合GMCS技术分析TCRBV基因家族谱系情况,方法稳定、简便,能较好地监测肺结核患者外周血T细胞TCR的β链谱型。

异基因造血干细胞移植受者T细胞受体β链CDR3谱型表达与巨细胞病毒激活

目的：探讨T细胞受体（TCR）β链可变区域（BV）的互补决定区（CDR3）谱型表达与异基因造血干细胞移植（HSCT）受者CMV激活的关系。方法：采用荧光定量PCR熔解曲线技术，扩增测序7例HSCT受者和3名健康对照者外周血单个核细胞的TCRBV家族CDR3谱型；采用免疫组织化学法检测外周血白细胞中的CMV—pp65抗原；应用ELISA法检测HSCT受者血清中的CMV—IgM。分析TCRBV家族CDR3表达与CMV激活的相关性。结果：3名健康对照者24个TCRBV家族均表达。7例HSCT受者术后TCRBV家族CDR3测序结果显示为BV9、BV11、BV17、BV20等BV家族序列；TCRBV9含“QVRGGTDTQ”，TCRBV11含“VATDEQ”和“LGDEQ”，TCRBV17含“IGQGNTEA”，TCRBV20含“VGLAANEQ”等共有氨基酸序列。抗原检测结果显示：术后3个月7例受者中有5例受者抗原血症阳性，CMV—pp65阳性细胞数为（2—15）个／5×10^4白细胞。抗体检测结果显示：术后3个月7例受者中3例受者CMV-IgM阳性。TCRBV家族CDR3的表达在CMV抗原血症阳性受者与抗原血症阴性受者之间差异无统计学意义（均P〉0．05）；但TCRBV11家族的表达在CMV-IgM阳性受者与CMV-IgM阴性受者之间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：HSCT受者在T细胞免疫应答中有特定的TCRBV家族CDR3谱型，其中TCRBV11的表达可能与CMV激活有关。

一种高效扩增人T细胞受体β链可变区基因的方法建立

目的:建立一种高效扩增人T细胞受体(TCR)β链可变区(Vβ)基因的方法。方法:根据TCRVβ26个亚家族基因序列特点设计扩增Vβ基因的上游内引物34条、上游外引物37条,并将内、外上游引物各分为8个简并组。在恒定区(C区)设计下游内、外和测序引物各1条以及扩增Cβ基因的上游引物1条。提取细胞RNA,用PolyA介导反转录后,采用巢式PCR扩增正常人CD8T细胞TCRVβ26个亚家族基因,并用JurkatT淋巴瘤细胞作为对照。用T-easy载体克隆RT-PCR产物,对克隆基因进行测序。结果:从正常人的CD8T细胞中扩增到所有TCRVβ亚家族基因,克隆后测序与相应的参考序列同源。从Jurkat细胞扩增出TCRVβ8基因,经测序验证与文献报道一致,且最少可从10个细胞提取的RNA模板中扩增成功。结论:建立的巢式RT-PCR方法可以高效、广谱地扩增人TCRVβ基因,为进一步进行抗原特异性细胞毒T淋巴细胞的TCR克隆和功能研究打下了良好基础。

免疫组库测序分析新生儿脓毒症患者外周血T细胞受体β链CDR3的多样性

目的采用免疫组库测序的方法分析新生儿脓毒症患者外周血T细胞受体(T cell receptor,TCR)β链互补决定区3 (complementarity determining region 3,CDR3)的多样性,探讨新生儿脓毒症的可能发病机制。方法 12例新生儿脓毒症确诊患儿为病例组,9例胎龄、出生体重及日龄相匹配的健康足月儿为对照组。采用Omega公司核酸纯化试剂盒(SQ Blood DNA Kit Ⅱ)从外周血样品中提取DNA,对TCRβ链CDR3进行多重PCR扩增,然后对产物进行高通量测序,分析其TCRβ链CDR3多样性及表达的差异。结果病例组和对照组的TCRβ链CDR3长度和类型相似,且均呈高斯分布。采用D50和香农-威纳指数作为多样性的评价指标,显示病例组TCRβ链CDR3多样性低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。针对TCRβ链V片段48个基因的使用频率进行比较,其中TRBV10-3、TRBV2和TRBV20-1的使用频率病例组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);对TCRβ链J片段13个基因的使用频率进行比较,其中TRBJ2-3、TRBJ2-5和TRBJ2-7的使用频率病例组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论新生儿脓毒症患者外周血TCRβ链CDR3多样性发生了明显改变,提示这可能与新生儿脓毒症的免疫发病机制有关。

寻常型天疱疮患者外周血T细胞受体β链可变区CDR3基因克隆谱型分析

目的:探讨寻常型天疱疮(PV)患者外周血T细胞受体(TCR)互补决定区(CDR3)基因谱型变化,了解克隆扩增的T细胞与自身免疫性疾病的相互关系。方法:采用免疫扫描谱型分析技术,分析6例正常人外周血单个核细胞TCRβ链可变区(BV)CDR3谱型分布特征以及6例PV患者CDR3谱型变化情况。结果:6例正常人TCRBVCDR3谱型均符合正态分布,6例PV患者TCRBVCDR3谱型均出现多态性降低,BV亚家族单/寡克隆增生。结论:PV患者外周血TCR可变区β链CDR3谱型异常可能与PV发病有关。

T细胞受体β链可变区基因在芳香族抗癫痫药物皮肤不良反应机制中的研究进展

芳香族抗癫痫药物(aromatic antiepileptic drugs,AAEDs)是临床抗癫痫治疗中常用的一类药物,较其他抗癫痫药物更易诱发皮肤不良反应(cutaneous adverse drug reactions,cADRs),严重者可致患者死亡。目前,AAEDs-cADRs的机制尚未阐明,可能的影响因素包括遗传、免疫、病毒、药物代谢等。其中,涉及免疫机制相关的研究结果显示,T细胞介导的免疫应答在AAEDs-cADRs中起重要作用,T细胞受体(T cell receptor,TCR)β链可变区(beta chain variable region,BV)基因会出现限制性取用。本文就TCR及TCR BV基因在AAEDs-cADRs机制中的研究进展进行综述。

高通量测序分析自身免疫性疾病T细胞受体β链CDR3组库的特征

自身免疫性疾病是机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。导致其发病的基本因素可能是自身免疫耐受的破坏。T细胞在自身免疫病的适应性免疫应答过程中起着至关重要的作用。每一个成熟的 T 细胞表面表达一种特定的T细胞受体（TCR），互补决定区3（CDR3）最能直接反应TCR多样性。 T 细胞对众多抗原的识别依赖于CDR3区的多样性，故对TCR CDR3区序列的分析，可作为判别 T 细胞抗原识别特性的重要指标。研究［1］发现高通量测序技术检测 TCR CDR3组库特征变化已被广泛应用，包括恶性肿瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病等。本文就自身免疫性疾病的TCRβ链CDR3组库特征变化的研究进展进行综述。

乳癌患者转移淋巴结中T细胞受体β链互补决定区3谱型分析

目的：：分析乳癌患者转移淋巴结标本中 T 细胞受体（TCR）β链互补决定区3（CDR3）的谱型偏移及氨基酸序列特点。方法：选取5例乳癌患者转移淋巴结和2例乳腺反应性增生患者的淋巴结标本，应用 RT-PCR 扩增 T细胞24个 TCR β链可变区（BV）亚家族，经基因扫描确定 T 细胞克隆性，对提示单、寡克隆性增生的 TCR BV 亚家族的 PCR 产物进行测序。结果：乳腺反应性增生患者淋巴结中 T 细胞均为多克隆性增生。乳癌患者转移淋巴结中T 细胞呈单、寡克隆及多克隆性增生，克隆性增生 T 细胞中存在2~5个 BV 亚家族的谱型偏移；CDR3氨基酸序列分析证实单、寡克隆性增生 T 细胞的 CDR3氨基酸序列呈现多样性的特点。结论：乳癌患者 TCR BV 亚家族取用存在谱型偏移，不同 T 细胞克隆的 CDR3氨基酸序列不同。

猪T细胞受体β链转录组与基因组分子结构研究进展

T细胞受体(TCR)是T细胞的表面标志,作为T细胞识别和结合内/外源性抗原的表面分子,TCR在免疫应答和免疫调节中发挥着重要的作用。但由于其基因的遗传多样性和结构复杂性,对猪αβT细胞特别是病原感染或免疫特异的克隆性增殖规律研究在国内尚属空白。随着对猪免疫系统的研究深入,对其TCR的研究也取得了很大进展,本文综述了猪TCRβ链不同组成区域的分类、转录组的多样性及复杂性、基因组的结构特征等方面的研究进展,以加深对猪TCR结构复杂性的认识和理解,为特异性TCR的筛选奠定理论基础。

临床孤立综合征患者外周血T细胞受体β链可变区多态性研究

目的分析临床孤立综合征患者外周血T细胞受体β链可变区(TCRVβ)多态性,初步预测特异性TCRVβ片段,研究其对临床孤立综合征的诊断价值。方法选择2012年9月至2014年3月诊断并接受治疗的临床孤立综合征患者30例(CIS组),以同期行健康体检的30例受试者为正常对照组。流式细胞术检测常规免疫学指标和TCRVβ亚家族表达变化,CELL Quest Pro 5.1等相关软件分析24个TCRVβ亚家族成员表达水平,并计算扩增者比例、扩增个数和扩增分数。结果TCRVβ24个亚家族中,CIS组CD4+TCRVβ2、4、5.2、5.3、7.1、8、14、17、20、21.3片段,以及CD8+TCRVβ4、14片段表达水平高于正常对照组,而CD4+TCRVβ11和CD8+TCRVβ9、11片段表达水平低于正常对照组(P<0.05或P<0.01)。CIS组CD4+TCRVβ(P=0.002)和CD8+TCRVβ14(P=0.010)扩增者比例均高于正常对照组,其余亚家族扩增者比例差异则无统计学意义(均P>0.05)。CIS组TCRVβ扩增者比例与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05),但扩增个数(P=0.001)、扩增分数(P=0.006)均高于正常对照组。受试者工作特征(ROC)曲线显示,CD4+TCRVβ4诊断临床孤立综合征的曲线下面积(AUC)为0.719(95%CI:0.592~0.851,P=0.003),灵敏度83.33%、特异度56.67%;CD4+TCRVβ14诊断的AUC为0.713(95%CI:0.581~0.845,P=0.005),灵敏度70%、特异度56.23%;CD8+TCRVβ4诊断的AUC为0.727(95%CI:0.600~0.854,P=0.002),灵敏度93.33%、特异度50%;以上3个片段对临床孤立综合征均具有中等诊断价值。结论虽然临床孤立综合征患者外周血CD4+TCRVβ4、CD4+TCRVβ14和CD8+TCRVβ4片段表达水平升高,但其诊断价值有限。

淋巴瘤患者行干细胞移植联合CD30嵌合抗原受体T细胞输注治疗的护理

目的 总结6例复发/难治性CD30阳性淋巴瘤患者进行自体干细胞移植联合抗CD30嵌合抗原受体T细胞输注治疗的护理经验。方法 对6例复发/难治性CD30阳性淋巴瘤患者,完善治疗前的护理评估,重点落实预处理毒性、细胞因子释放综合征以及植入综合征的护理,并将心理支持及健康教育纳入整个治疗过程。结果 6例患者均成功植入造血干细胞,外周血中检测到持续性CAR30转基因,其中5例完全缓解,1例部分缓解。5例出现细胞因子释放综合征,均为Ⅰ级,未观察到神经毒性。随访20.4(12.1,34.4)个月,患者均存活并保持其反应性。结论 自体干细胞移植联合抗CD30嵌合抗原受体T细胞输注治疗具有良好的耐受性和高度活性,护理在治疗各阶段以及毒副反应管理中发挥重要作用。

肺癌患者外周血和胸腔积液T细胞受体组库特征分析

目的 比较肺癌患者外周血和胸腔积液的T细胞受体(TCR)组库的免疫学特征。方法 收集2020年7月至2021年1月在复旦大学附属中山医院就诊的5例合并恶性胸腔积液肺癌患者的外周血和胸腔积液,分离外周血单个核细胞(PBMC)和胸腔积液单个核细胞(PEMC),提取基因组DNA,采用Illumina MiSeq平台对TCR进行高通量测序,分析TCR组库的多样性等特征。结果 PBMC和PEMC中的TCR克隆型、VJ pairs和互补决定区3(CDR3)序列的多样性和相关性差异均无统计学意义。PBMC中检测到的TCR克隆数量高于PEMC(P<0.05),VJ pairs和CDR3数量与PEMC差异无统计学意义。PBMC和PEMC配对样本的共有VJ pairs数量占总VJ pairs的比例高于共有克隆型和CDR3序列的数量比例(P<0.05),后两者差异无统计学意义。PEMC中高扩增克隆(HEC)数量和占比均高于PBMC。同时鉴定了36个在PBMC和PEMC中差异表达的VJ pairs,其中25个在PEMC中表达升高、9个在PEMC中表达降低。结论 肺癌患者外周血和胸腔积液的TCR组库表现出不同的特征性变化,可能为肺癌重要的免疫病理学特征。

复发难治弥漫大B细胞淋巴瘤的二线治疗:自体造血干细胞移植或嵌合抗原受体T细胞治疗?

弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是最常见的侵袭性淋巴瘤亚型。一线规范的治疗后,60%的患者可以实现治愈,但是仍有40%的患者复发或者难治,预后不佳。挽救性化疗联合自体造血干细胞移植(ASCT)是化疗敏感患者的标准二线治疗方案。然而,伴随着新的治疗方式,如嵌合抗原受体T细胞疗法、双特异性抗体、靶向药物等的出现,标准二线治疗方案受到一定的挑战,尤其对于挽救性化疗不够敏感的患者。本文对目前复发难治DLBCL的二线治疗的安全性和疗效及适应证进行综述,以探讨复发难治DLBCL的最佳治疗选择。

基于“壮火”理论辨治嵌合抗原受体T细胞治疗相关细胞因子释放综合征的经验

细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,CRS)是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗引起的最常见的不良反应,往往以发热为突出表现。基于《黄帝内经》“壮火”理论,以发热为切入点,认为CAR-T治疗相关CRS的主要病机在于阳气亢极而阴相对不足,从而表现出燔灼炎热、食气伤阴的致病特点。中医辨治以调整阴阳、分期论治为治疗原则,解毒透邪兼以扶正固本,旨在恢复机体稳态以重新达到动态平衡,从而治疗CAR-T疗法引起的免疫毒性反应。

基于LCK募集和活化的嵌合抗原受体T细胞的结构优化及其功能研究

目的 通过对二代嵌合抗原受体(CAR)进行淋巴细胞特异蛋白酪氨酸激酶(LCK)结构改造,探讨能否增强二代CD137 CAR-T细胞的活化水平及杀伤肿瘤细胞效率,为制备新型二代CAR-T细胞奠定基础。方法 利用基因工程技术,构建靶向人表皮生长因子受体-2(HER2)的CD137-LCK2 CAR和CD137-PYAP2 CAR的慢病毒载体,经慢病毒包装、感染活化T细胞后制备出CD137-LCK2和CD137-PYAP2 CAR-T细胞。采用流式细胞术、酶联免疫吸附实验、细胞毒性实验分别检测新构建的CAR-T细胞在活化分子CD137的表达水平、表型分布、分泌的细胞因子水平及对表达HER2的肿瘤细胞的杀伤效率。结果相较于二代CD137 CAR-T细胞,经过结构改造的靶向HER2的CD137-LCK2和CD137-PYAP2 CAR-T细胞能够上调活化分子CD137的表达、增加细胞因子IFN-γ的分泌、增强对靶细胞的杀伤能力,且均有统计学差异;同时能够维持在记忆状态、受抗原刺激后可迅速活化增殖分化。结论 靶向HER2的CD137-LCK2和CD137-PYAP2 CAR-T细胞有望比二代CD137 CAR-T细胞能更有效活化并发挥抗肿瘤效应。

嵌合型抗原受体T细胞在恶性黑色素瘤中应用进展

恶性黑素瘤细胞膜表达有多种生物标志物,可作为治疗靶点开发针对性的嵌合型抗原受体T细胞(CAR-T),CAR-T目前对恶性黑素瘤中GD2、HER2、CD70、Gp100、NYESO-1等靶点已表现出良好的疗效。本文旨在梳理恶性黑素瘤CAR-T靶点及临床进展,分析工程化T细胞的挑战与应对之策,以期CAR-T应用于恶性黑素瘤临床实践。

共抑制受体T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域免疫抑制机制的研究进展

恶性肿瘤的发生、发展与免疫检查点受体有紧密联系,肿瘤细胞可以通过激活免疫检查点来逃避免疫监视。T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域(TIGIT)是一种在免疫细胞上表达的抑制性受体。TIGIT可以通过多种机制抑制T细胞和天然杀伤(NK)细胞等免疫细胞的功能,使肿瘤细胞逃避免疫系统的监视,本文将对TIGIT的免疫抑制机制研究进展进行系统综述。

嵌合抗原受体T细胞治疗在心肌纤维化中的研究进展

嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗是目前细胞免疫治疗中最热门的研究领域,在肿瘤治疗中有着辉煌的成就。随着研究的深入,CAR-T细胞治疗在非肿瘤疾病中也有着重大的突破。CAR-T细胞作为过继性T细胞的一种,结合了抗体的抗原结合特性和T细胞的效应功能,能靶向消除特定的细胞。对于尚无有效治疗措施的心肌纤维化,CAR-T细胞治疗可能是一个新的治疗思路与方向。现就目前CAR-T细胞治疗在心肌纤维化中的研究进展做一综述。

嵌合抗原受体T细胞治疗B细胞性急性淋巴细胞白血病的护理策略研究

探究嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(chimeric antigen receptor T cell immuno-therapy,CAR-T)治疗B细胞性急性淋巴细胞白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)的护理策略。急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是一种临床常见的异质性很高的恶性血液病。CAR-T作为一种新兴的治疗方法,已经在B-ALL患者的治疗中表现出显著疗效。通过分析广东省第二人民医院接受CAR-T治疗的复发/难治性B-ALL患者的临床资料,对比采用规范化医疗及护理体系干预前后CAR-T治疗B-ALL的疗效及不良反应差异。结果显示,规范化医疗及护理体系干预对CAR-T治疗B-ALL的疗效无显著影响,但能够降低细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,CRS)的严重程度。研究发现,CAR-T治疗复发/难治性B-ALL疗效显著,通过规范化医疗及护理体系建设,能够增强医护人员CAR-T治疗全程管理能力,尤其是CAR-T细胞回输后相关并发症的早期观察、早期预防及早期处理能力,保障患者的治疗效果,降低不良反应发生率。

嵌合抗原受体T细胞治疗过程中真菌感染的预防与治疗

嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T-cell,CAR-T)治疗是近几年在血液恶性肿瘤治疗领域新兴的一种治疗方法,CAR-T在体内扩增,激活后释放大量的细胞因子从而引发全身炎症反应,即细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,CRS)。此外,由于B细胞也会表达作为CAR-T对肿瘤细胞进行识别的CD19受体,因此接受CAR-T治疗的患者会出现B细胞发育不良的情况,导致免疫球蛋白(主要为IgG)的产生减少,IgG含量的降低,从而增加治疗过程中患者受到微生物感染的风险。