嵌合型抗原受体基因修饰的T细胞研究进展

肿瘤免疫治疗在肿瘤治疗中发挥的作用日益受到重视，而作为肿瘤免疫治疗重要组成部分的过继性细胞治疗（ Adoptive cellular therapy ，ACT），因其可在短时间内扩增和活化具有抗瘤活性的效应细胞，治疗副作用轻微等优点而在临床研究中备受关注。TIL、CIK、NK、NKT和γδT这些用于ACT的细胞在临床应用研究中取得一定的疗效，但是肿瘤抗原特异性强、亲和力好的免疫细胞来源困难、数量较少，以及杀瘤活性、体内持续时间未能达到临床应用的需求，在一定程度上制约了ACT的发展［1］。于是，研究者尝试使用基因修饰T细胞来解决这个问题，用来修饰 T 细胞的基因有 TCR、CAR （ Chimeric antigen receptor ，嵌合型抗原受体）、促进免疫细胞增殖的细胞因子（如IL-2、IL-15）等［2］。其中，嵌合型抗原受体基因修饰的 T 细胞（ Chimeric antigen receptor-modified T cells，CART）是以能编码单链抗体-共刺激分子-免疫受体酪氨酸活化基序的嵌合分子的融合基因修饰T细胞而产生的一种基因修饰T细胞。因其具有肿瘤抗原识别特异性强、亲和力高、非MHC限制性及可在体内外大量扩增的优点而受到较多的关注，本文将对 CART 的研究进展予以综述。

嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞在肿瘤免疫治疗中的研究

近年来运用嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)基因修饰T淋巴细胞治疗白血病、神经胶质瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤等恶性肿瘤,取得令人可喜的成果。CAR基因修饰T淋巴细胞主要将能够识别肿瘤相关抗原的单链抗体和T细胞胞内活化基序借助铰链结构连接为一体,通过基因转导T淋巴细胞,赋予T淋巴细胞对肿瘤抗原的高亲和性及特异性杀伤能力。在针对CAR治疗肿瘤研究中,"脱靶效应"、"细胞因子风暴"、免疫抑制等问题使得CAR技术发展受到阻碍。因此,临床需要采取应对措施使CAR能够安全有效地应用。本篇综述将针对CAR近些年在治疗恶性肿瘤的发展情况和未来应用前景进行阐述。

盐酸青藤碱抑制急性T淋巴细胞白血病CEM细胞株的作用及转录组学分析

背景:盐酸青藤碱有抗多种肿瘤的作用,但目前尚不清楚盐酸青藤碱对急性T淋巴细胞白血病的作用。目的:探讨盐酸青藤碱对急性T淋巴细胞白血病CEM细胞的抑制作用。方法:应用不同浓度(0.5,1,2,4 mmol/L)盐酸青藤碱处理CEM细胞,CCK-8检测细胞增殖抑制率并计算IC50;倒置显微镜和吉姆萨染色观察CEM细胞形态变化;利用RNA-Seq测序分析差异基因表达并进行生物信息学分析。结合转录组测序结果,流式细胞术检测不同浓度(1,2,4 mmol/L)盐酸青藤碱作用后CEM细胞凋亡率;Western blot检测不同浓度(1,2,4 mmol/L)盐酸青藤碱作用后CEM细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-9蛋白的表达。结果与结论:①盐酸青藤碱呈剂量和时间依赖性地抑制CEM细胞生长;②盐酸青藤碱干预后CEM细胞数量下降,核固缩;③RNA-seq测序筛出53个异常表达基因,基因本体分析主要富集在细胞过程、细胞解剖实体与粘连关系等,信号通路分析与肿瘤相关的是细胞凋亡;④盐酸青藤碱呈剂量依赖性地促进CEM细胞凋亡;⑤盐酸青藤碱上调CEM细胞中Bax、Caspase-9蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达。由此可见,盐酸青藤碱可诱导CEM细胞凋亡从而抑制细胞增殖,可能与其上调Bax和Caspase-9蛋白表达,以及下调Bcl-2蛋白表达有关。

嵌合抗原受体基因修饰T细胞治疗胶质母细胞瘤的研究进展

胶质母细胞瘤(GBM)是成人最常见、最致命的原发性脑肿瘤。目前GBM的常规治疗包括手术、局部和全身化疗、放疗等,但治疗效果常不理想。嵌合抗原受体基因修饰T细胞(CAR-T细胞)治疗作为一种新的过继性免疫疗法,已经在血液肿瘤治疗中取得了较好的临床效果。CAR-T细胞可穿过血脑屏障,且不通过抗原呈递、不依赖主要组织相容性复合物即可识别预定义的肿瘤表面抗原。在GBM体外试验中,CAR-T细胞治疗的效果显著,但其临床应用仍存在诸多挑战。

T细胞受体基因修饰在肿瘤免疫细胞治疗中的应用及研究进展

长期以来,人们一直期望能够用一种有效的手段来控制和治愈肿瘤,并且不断地探索和研究肿瘤治疗的新方法。近些年来细胞免疫治疗已经成为继手术、放疗、化疗之后在恶性肿瘤治疗中具有巨大前景的一种治疗方法。T细胞受体（T cell receptor,TCR）基因修饰T细胞治疗是将针对肿瘤特异性抗原的受体导入T细胞中,再将这些基因修饰T细胞回输给患者达到治疗肿瘤的目的。

嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞治疗肺癌的研究进展和挑战

近年来,免疫疗法尤其是单克隆抗体靶向药物越来越多地应用于肺癌的临床治疗,但仍有很多局限性。嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞(chimeric antigen receptor gene modified-T lymphocytes,CAR-T)疗法对于部分B细胞淋巴瘤和白血病的疗效显著,也为实体瘤的免疫治疗开辟了新途径。肺癌CAR-T疗法的热门靶点包括间皮素(MSLN)、黏蛋白突变体(TnMUC1)、表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2(HER2)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)和δ样配体3(DLL3)等,但相关临床研究均处于早期探索阶段。所面临的主要障碍包括脱靶毒性、肿瘤免疫抑制微环境和CAR-T细胞体内效能不足等。通过基因编辑改进CAR结构、设计多靶点CAR或组合应用多靶点CAR-T细胞、精细调控CAR-T细胞体内动态分布、改进给药方式或联合其他免疫治疗等策略可能有助于解决这些问题。

嵌合抗原受体基因修饰T细胞免疫疗法在肺癌治疗中的研究进展

肺癌是全世界所有癌症中发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一,目前仍缺乏较好的治疗手段。嵌合抗原受体基因修饰T(CAR-T)细胞免疫疗法作为一种新的治疗方法在血液系统恶性肿瘤中疗效显著,也为肺癌等实体肿瘤的免疫治疗开辟了新途径。然而,由于实体瘤的异质性、肿瘤微环境免疫抑制、肿瘤靶抗原逃逸及脱靶毒性等问题,造成CAR-T细胞免疫疗法在肺癌治疗中的应用存在挑战和障碍。本文总结了CAR-T细胞免疫疗在肺癌治疗中的最新研究进展,包括CAR-T细胞生物学特征、靶点选择、早期临床研究和治疗不良反应,并提出肺癌CAR-T细胞免疫疗法的优化策略,旨在为肺癌的临床免疫治疗提供新思路。

嵌合抗原受体基因修饰的T细胞免疫治疗骨肉瘤的研究进展

骨肉瘤(OS)是一种常见骨恶性肿瘤。常规治疗方式对患者预后生存率有一定改善,但对已转移患者的作用十分有限。靶向骨肉瘤相关抗原的嵌合抗原受体基因修饰的T细胞(CAR-T)疗法是一种很有前景的治疗方式。包括靶向HER-2、IL-11Rα、ROR1和GD2等骨肉瘤相关抗原的特异性CAR-T治疗在一些基础和临床研究中均有报道,且已经表现出了对骨肉瘤良好的治疗效果。

嵌合抗原受体基因修饰T细胞早期临床试验的探讨

目的对影响早期临床试验设计的因素进行探讨,并深入分析早期临床试验的设计原则和方法。方法从产品特征、临床前研究、安全性风险等方面分析CAR-T细胞临床试验的影响因素,并从试验目的、研究对象、试验设计等角度总结CAR-T细胞早期临床试验的考虑要点。结果 CAR-T细胞的产品特征、临床前研究方法和安全性风险与其它药物有显著差异,对早期临床试验有重要影响。结论在早期临床试验中探索CAR-T细胞的有效剂量、不良反应、初步的有效性非常重要,此外,还应在早期临床试验中验证CAR-T细胞的临床可及性及工艺稳定性。

IL-2基因修饰的细胞毒T淋巴细胞抗肿瘤效应的研究

目的:了解IL2基因修饰的细胞毒T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytesCTL)的增殖和杀伤活性,探索细胞因子基因疗法及被动免疫治疗脑胶质瘤的新途径。方法:用昆明种小鼠的脾细胞体外诱导CTL,用腺病毒载体转染IL2基因,观察其体外增殖活性和杀伤活性,再用G422小鼠胶质母细胞瘤细胞建立肺转移瘤模型,36h后经过继回输,2周后计数肺的肿瘤结节,观察IL2基因转染的CTL对实验性肺转移瘤的治疗作用。结果:重组腺病毒载体在MOImultiplicityofinfection为100时,转染率达96.8%,IL2基因修饰的CTL增殖活性、IL2的分泌(248u)和体外杀伤活性36.4%明显增强,对实验性肺转移瘤的治疗作用都显著增强,肺转移结节数28显著减少(P<0.01)。结论:IL-2基因转染的CTL过继回输,可直接杀伤和诱导激活机体特异性抗肿瘤免疫反应,使体内抗肿瘤效果显著增强,有效抑制实验性肺转移瘤的生长,为胶质瘤的过继免疫治疗提供了新的思路和实验依据。

一例嵌合抗原受体修饰的T细胞治疗过程中腮腺炎并窦道形成的护理

回顾分析1例嵌合抗原受体修饰的T细胞治疗过程中出现严重腮腺炎并窦道形成的案例。充分评估伤口情况,多种清创方式相结合清除伤口坏死组织;亲水纤维银敷料外敷促进伤口愈合;加强全身营养支持及抗感染治疗;给予心理支持及舒适护理。经过精心治疗和护理,患者伤口痊愈。

MHCI类抗原多肽致敏IL-2基因修饰的树突状细胞对小鼠引流淋巴结T细胞亚群的影响及其免疫保护作用

目的 :探讨MHCI类分子限制性肿瘤抗原多肽Mutl体外冲击白细胞介素 2 (Interleukin 2 ,IL 2 )基因修饰的树突状细胞 (Dendrticcells,DC)对小鼠体内特异性免疫的活化机制。方法 :用腺病毒作为载体介导小鼠IL 2基因修饰DC ,用小鼠Lewis肺癌 3LL细胞株MHCI类分子限制性八肽Mutl冲击IL 2基因修饰的DC(DC IL 2 Mutl)免疫小鼠 ,用流式细胞术 (FACS)分析免疫保护小鼠接受 3LL细胞再攻击后引流淋巴结内T细胞亚群的比例变化。结果 :用Mutl冲击的DC免疫的小鼠抵抗3LL细胞再攻击时 ,引流淋巴结内CD8+ T淋巴细胞比例明显升高 ,DC IL 2 Mutl免疫保护的小鼠接受 3LL细胞再攻击后引流淋巴结内CD8+ 和NK细胞的比例都明显升高。结论 :研究表明MHCI类分子限制性肿瘤抗原多肽体外冲击IL 2基因修饰的DC免疫小鼠 ,能诱导小鼠产生特异性抗肿瘤免疫应答 。

T细胞分化群40补体免疫球蛋白基因修饰骨髓间充质干细胞在肝移植排斥反应中的作用

目的探讨T细胞分化群40补体免疫球蛋白(CD40LIg)基因修饰骨髓间充质干细胞(MSCs)肝移植排斥反应中的作用。方法采用双袖套法建立DA-Lewis大鼠原位肝移植模型,经门静脉输注CD40LIg基因转染的MSCs,观察大鼠肝移植术后肝功能的变化、生存情况和移植肝病理形态学的改变,检测肝移植大鼠干扰素(INF-γ)和白细胞介素4(IL-2)水平的变化。结果(1)基因转染MSCs组生存时间显著长于对照组、单纯MSCs组和基因转染组,而单纯MSCs组和基因转染组又较对照组显著延长(P<0.05)。(2)对照组谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBil)、IL-2和INF-γ水平在肝移植术后急剧升高,各时段均显著高于3个治疗组(P<0.05);(3)肝脏组织病理检查,对照组呈重度排斥反应,单纯MSCs组和基因转染组为轻度排斥反应,而基因转染MSCs组无明显排斥反应。结论 CD40LIg基因修饰MSCs可以延长肝移植大鼠的存活时间,抑制大鼠肝移植的排斥反应。

CTLA4-Ig基因修饰骨髓间充质干细胞抑制大鼠肝移植排斥反应

目的探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA4-Ig)基因转染骨髓间充质干细胞(MSC)在抑制大鼠原位肝移植排斥反应的作用及机制。方法采用重组腺病毒(Ad)5-CTLA4-Ig转染MSC。转染72 h后,提取细胞总蛋白,采用蛋白质印迹法检测转染后MSC中CTLA4-Ig的蛋白表达。采用细胞计数试剂盒(CCK)-8方法检测未转染和转染后的MSC对外周血淋巴细胞增殖的抑制作用。以雄性Lewis大鼠为供体(40只);以雄性Brown Norway(BN)大鼠为受体(40只)。采用改良的Kamada两袖套法进行原位肝移植,建立大鼠原位肝移植急性排斥反应模型。40只受体大鼠随机分为4组,每组10只。其中对照组(A组),于肝移植时门静脉输注生理盐水;MSC治疗组(B组),于肝移植时门静脉输注MSC;转基因MSC治疗组(C组),于肝移植时门静脉输注转基因MSC;免疫抑制剂治疗组(D组),于肝移植时门静脉输注生理盐水,术后即给予环孢素(CsA)1.5 mg/(kg·d)肌内注射,连续8 d。每组大鼠取5只观察生存情况。每组其余5只于术后第9日处死,检测外周血细胞因子白细胞介素(IL)-2、IL-4、干扰素(IFN)-γ水平,光学显微镜下观察肝组织病理学变化和排斥反应程度。结果重组Ad5-CTLA4-Ig转染MSC 72 h后,蛋白质印迹法可检测到转染后的MSC中有CTLA4-Ig的蛋白表达。当未转染的MSC∶外周血单核细胞比例为1∶10、1∶20时,MSC抑制淋巴细胞增殖的作用分别为85.60%、76.69%。重组Ad5-CTLA4-Ig转染MSC 72 h后,在相同的数量比下,其抑制淋巴细胞增殖的作用分别为90.50%、84.20%;与未转染的MSC比较,转染后抑制淋巴细胞增殖的作用增强(P<0.05)。A、B、C、D组大鼠肝移植术后存活时间分别为(13±3),(41±6),(90±15),(102±18)d。A、B、C组的大鼠术后存活时间比较差异有统计学意义(P<0.05),C组和D组的大鼠术后存活时间比较差异无统计学意义(P>0.05)。与A组比较,B组和C组的IL-4水平明显升高;与B组比较,C组的IL-4水平明显升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05);C组和D组的IL-4水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与A组比较,B组和C组的IL-2、IFN-γ水平明显降低,C组的IL-2、IFN-γ水平亦低于B组,差异均有统计学意义(均为P<0.05),C组和D组的IL-2、IFN-γ水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。大鼠肝组织病理检查结果显示,A组移植肝发生重度排斥反应,B组移植肝亦发生排斥反应,但与A组比较程度较轻。C组与D组移植肝有轻度排斥反应。结论重组Ad-CTLA4-Ig转染MSC可抑制肝移植排斥反应,其效果优于MSC单独应用。

红景天苷促进MC3T3-E1细胞成骨分化能力的体外实验

背景:骨缺损可直接影响牙齿种植的成功率及种植体的长期稳定性。研究显示红景天苷可促进成骨细胞增殖、分化,但对于其成骨分化相关通路具体研究不多。目的:体外细胞实验研究红景天苷对MC3T3-E1细胞增殖和分化的影响,并探究其对相关基因和蛋白表达的影响。方法:采用CCK-8实验和碱性磷酸酶实验筛选红景天苷(0.5,1,5,10,50μmol/L)促进MC3T3-E1细胞增殖和分化的最佳浓度。实验分为4组:对照组、红景天苷组、红景天苷+LY294002组、LY294002组,分别用成骨诱导液、含10μmol/L红景天苷、10μmol/L红景天苷+10μmol/L LY294002、10μmol/L LY294002的成骨诱导液进行培养,观察红景天苷及PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002对成骨相关基因和蛋白表达的影响。结果与结论:①CCK-8实验和碱性磷酸酶实验显示:红景天苷促进MC3T3-E1细胞增殖的作用在10μmol/L时最显著;②与对照组相比,红景天苷可以促进矿化、促进细胞黏附、减少细胞死亡,提高Runx-2、骨钙素、骨桥蛋白的mRNA表达(P<0.01),提高Runx-2和p-Akt蛋白表达(P<0.01);而添加PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002则可逆转以上结果;③结果表明,红景天苷能促进MC3T3-E1细胞矿化,并能促进成骨相关基因、蛋白的表达,这可能与PI3K/Akt信号通路的激活有关。

GM-CSF基因修饰同种异体肺癌细胞疫苗诱导CD8^+ T细胞的免疫反应

目的探讨GM-CSF基因修饰同种异体肿瘤疫苗是否可诱导CD8+ T细胞的特异性免疫反应。方法以接种Lewis肺癌(Lewis Lung Cancer,LLC)细胞株的C57BL小鼠作为动物模型。利用含小鼠粒-巨细胞集落刺激因子(macrophage-colony-stimulating factor,GM-CSF)基因的重组质粒GM-CSF-pIRES2-EGFP,转染小鼠肺癌细胞株LA795,制备同种异体肿瘤疫苗。C57BL小鼠预防接种该疫苗3次后,皮下接种LLC细胞株,分别于免疫前、每次疫苗注射后采集小鼠脾淋巴细胞,采用ELISPOT法检测淋巴细胞经LLC抗原刺激后的活化;脾细胞及其中的CD8+ T细胞对LLC细胞株的杀伤活性;同时采用免疫组化方法检测注射部位淋巴细胞浸润情况。结果疫苗注射部位可见明显的CD8+T细胞浸润;经ELISPOT方法检测,GM-CSF基因修饰LA795疫苗接种后,小鼠脾淋巴细胞经LLC抗原刺激后活化细胞比例均显著升高(P<0.01);同时,脾细胞及其中的CD8+ T细胞对LLC细胞的杀伤活性明显升高(P<0.05)。结论GM-CSF分泌性同种异体瘤苗可诱导CD8+ T细胞的活化,以及对自体肿瘤细胞的杀伤,即可诱导特异性抗肿瘤免疫反应。

bcr/abl基因修饰树突细胞疫苗诱导CTLs杀伤K562细胞体外实验研究

背景与目的:T细胞介导的特异性免疫效应在慢性粒细胞白血病的治疗中发挥着重要作用,而以树突细胞(dendriticcell,DC)为中心的免疫治疗是目前肿瘤生物免疫学治疗的热点之一。本研究以复制缺陷型重组腺病毒为载体,介导慢性粒细胞白血病bcr/abl基因片段转导DC制备疫苗,观察bcr/abl基因修饰DC疫苗诱导产生的特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)在体外对白血病K562细胞的杀伤效应。方法:应用RT-PCR法扩增慢性粒细胞白血病bcr/abl基因片段,构建复制缺陷型重组腺病毒质粒,并包装产生重组腺病毒。体外诱导培养外周血单个核细胞来源DC,观察DC分别经重组腺病毒转染及多肽负载后,诱导产生特异性的CTLs在体外对白血病K562细胞的杀伤效应。结果:成功构建了携带bcr/abl基因片段的复制缺陷型重组腺病毒表达载体,包装产生的重组腺病毒滴度高达2.0×1010pfu/mL。体外转染DC效率达到50%～60%,成功制备了bcr/abl特异性DC疫苗。体外实验中,在40:1和20:1效靶比下,bcr/abl基因修饰DC疫苗对K562细胞的杀伤效应分别为(47.6±4.7)%和(47.5±1.6)%,多肽负载DC为(25.8±4.4)%和(24.6±6.3)%,空白DC为(5.7±1.3)%和(4.5±1.6)%,基因修饰DC疫苗诱导的杀伤效应明显高于多肽负载及空白组(P<0.05)。结论:以重组腺病毒为载体介导bcr/abl基因片段转导DC制备的基因修饰DC疫苗,具有显著的诱导CTLs杀伤白血病K562细胞的作用。

CMVpp65基因修饰的树突状细胞刺激自身T细胞活化

巨细胞病毒(CMV)感染易发生于慢性移植物抗宿主病(cGVHD)患者,其特异性免疫依赖于T细胞活性。本研究探讨CMV pp65基因修饰的树突状细胞(DC)对自身T细胞的活化作用。采用具有高效转染非分裂细胞的慢病毒系统将CMV全长pp65基因导入鼠源性DC;采用CpG-DNA诱导DC细胞成熟;采用流式细胞术及免疫荧光方法测定T淋巴细胞抗原及IFNγ表达。结果表明:慢病毒感染DC的感染复数(multiplicity of infection,MOI)为50,最佳感染效率可达30%-40%;表达pp65基因的成熟DC能刺激自身naiveT细胞表达CD69;表达PP65蛋白的成熟DC能够刺激自身CD4+或CD8+T细胞分泌IFNγ。结论:pp65基因修饰、CpG-DNA诱导成熟的DC能体外激活CMV特异性T淋巴细胞。

基因修饰T淋巴细胞在肿瘤免疫治疗中的应用

基因修饰T细胞是指利用基因工程方法对T细胞进行基因修饰,通过提高T细胞对抗原的结合能力、增强活化信号的疗复耐转导、延长T细胞在体内的生存时间、增加肿瘤组织中活化T细胞的数量以及改进基因免疫治疗的安全性,最终达到提高T细胞肿瘤免疫治疗的疗效。尽管该方法还存在许多问题,但是最近几年经基因修饰T细胞过继性免疫治疗在基础与临床研究方面均取得了可喜的进展。随着人们对肿瘤免疫研究的深入和基因工程技术的快速发展,基因修饰的T细胞在肿瘤免疫治疗中将有广阔的应用前景。

微囊化血管内皮细胞生长因子基因修饰NIH3T3细胞的制备及体外培养

目的:制备微囊化血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因修饰NIH3T3细胞,并研究微囊化技术对VEGF基因修饰NIH3T3细胞增殖及其分泌VEGF功能的影响。方法:应用海藻酸钠-氯化钡技术制备微囊化VEGF基因修饰NIH3T3细胞。并与未微囊化VEGF基因修饰NIH3T3细胞对照培养,在倒置相差显微镜下观察微囊及细胞形态,用MTT法和PI染色流式细胞术检测细胞的增殖及活性情况。每48 h收集微囊化及未微囊化基因修饰NIH3T3细胞培养上清,-20℃保存.ELISA法检测培养上清VEGF的含量。结果:微囊形态较圆整,其内细胞生长良好;两组细胞增殖与活性及培养上清中VEGF含量无统计学差异。结论:微囊化并不影响基因修饰细胞的生长代谢功能,与对照组比较.在体外培养时生物学特性无明显差异,为研究微囊化基因修饰细胞体内移植奠定了基础。