定量检测T细胞受体重排删除DNA环含量评价急性非淋巴细胞白血病患者胸腺近期输出功能

目的检测急性非淋巴细胞白血病(ANLL)患者T细胞受体重排删除DNA环(signaljoint T-cell receptor exc ision DNA c irc les sjTRECs,TRECs)的含量,从而探讨患者的初始型naive T细胞水平和胸腺近期输出功能特点。方法利用实时定量PCR(TaqM an)方法,检测77例ANLL患者外周血单个核细胞(PBMC)TRECs的水平,并根据外周血中CD3阳性率计算CD3细胞中TRECs水平。14例ANLL缓解期患者和14例正常人外周血作为对照。结果ANLL患者外周血中TRECs含量为(0.43±0.92)拷贝/1 000 PBMCs,(2.02±3.25)拷贝/1 000 CD3+细胞,明显低于正常人TRECs水平[(4.10±3.65)拷贝/1 000 PBMCs和(6.84±4.71)拷贝/1 000 CD3+细胞,P=0.0000和P=0.0001]和缓解期患者[(2.19±2.49)拷贝/1 000 PBMCs和(6.30±7.13)拷贝/1 000 CD3+细胞,P=0.0000和P=0.0005]。各亚型ANLL患者的TREC水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论绝大多数ANLL型患者胸腺近期输出naive T细胞功能明显降低,缓解期患者的胸腺近期输出功能有一定程度恢复。

胸腺输出功能的评价手段—T细胞受体重排删除环的定量分析

多年来 ,因缺乏合适的检测胸腺输出naiveT细胞的技术 ,未能明确胸腺输出功能。由于胸腺T细胞的分化始于T细胞受体 (TCR)基因的重排 ,在TCRα基因重排时 ,通过δRec和 ψJα基因片段重组形成染色体外DNA环而删除TCRδ基因 ,该删除环称为信号结合T细胞受体重排删除环 (sjTRECS)或TRECs。TRECs十分稳定 ,不扩增且随着细胞增殖而稀释 ,故近期研究认为对TRECs的定量检测可以直接地估计胸腺的输出功能。本文综述了TRECs定量分析在评价正常人和造血干细胞移植 ,血液肿瘤、HIV感染和自身免疫性疾病等等的胸腺输出功能中的作用。

清髓性非血缘脐血与同胞供体造血干细胞移植后T淋巴细胞亚群及其受体重排删除环早期重建规律的比较分析

本研究比较分析清髓性非血缘脐血移植(UCBT)与同胞供体骨髓和/或外周血干细胞移植(BMT/PBSCT)后恶性血液病受者早期T细胞亚群及T细胞受体重排删除环(T-cell receptor excision cycles,TREC)的重建规律。用流式细胞术检测40例恶性血液病患者清髓性异基因造血干细胞移植后6个月外周血中T细胞亚群的变化,实时定量PCR检测TREC。结果表明,UCBT与BMT/PBSCT相比,在移植后1个月内CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞绝对值明显降低,此后无明显差别;2个月内CD3+细胞比例较低,但无明显差别。UCBT同BMT/PBSCT类似,CD3+CD4+细胞自植入开始即明显减低,2个月达最低,以后缓慢恢复,但至6个月仍未达正常;而CD3+CD8+亚群植入时已达正常水平,CD4+/CD8+比值至6个月仍低于正常。UCBT组在移植后1个月内naive T细胞明显高于BMT/PBSCT组;而在移植后3个月开始终末分化效应记忆T细胞明显高于BMT/PBSCT组,且明显高于正常对照组。移植后6个月内两组移植受者TREC均较低。结论:与同胞供体BMT/PBSCT相比较,UCBT后早期T细胞重建显著延迟,但终末效应记忆T细胞亚型水平明显升高,从而发挥着抗感染或抗白血病作用。

TaqMan-MGB探针实时荧光PCR法检测T细胞受体重排删除环评估慢性乙型肝炎患者胸腺近期输出功能

目的:建立一种快速、准确检测T细胞受体重排删除环(TRECs)的方法,用来评价慢性乙型肝炎患者胸腺输出功能。方法:根据T细胞受体(TCR)基因序列设计引物与探针,建立TaqMan-MGB双标记探针技术定量测定外周血中TRECs的含量,通过重复性、敏感性、准确性实验评价该方法的可靠性;并将此技术应用于慢性乙型肝炎中型(CHB)患者中评价胸腺输出功能。结果:通过多次试验成功建立了检测TRECs含量的TaqMan-MGB双标记探针实时荧光定量检测方法,并对5×10~5copies的质粒进行10倍法稀释,最低检出可达50 copies;对6. 18 Lg copies/10~6PBMCs和3. 54 Lg copies/10~6PBMCs高低浓度标本同一批次进行25次检测结果平均值为6. 08±0. 14,3. 52±0. 18 Lg copies/10~6PBMCs批内变异系数分别为2. 26%,5. 12%,对这两份标本连续5 d重复20次试验结果平均值为6. 10±0. 23,3. 51±0. 22 Lg copies/10~6PBMCs批间变异系数分别为3. 85%、6. 27%;用双蒸水代替模板进行检测无目的基因扩增。35例健康成年人外周血TRECs平均含量为5. 62±1. 38 Lg copies/10~6PBMCs,45例同年龄段CHB患者外周血TRECs平均含量为4. 09±0. 97 Lg copies/10~6PBMCs,两者差异存在统计学意义(t=11. 25,P <0. 05)。结论:Taq Man-MGB双标记探针时荧光定量PCR技术检测TRECs特异性强,灵敏度高,重复性好;成年CHB中型患者外周血TRECs含量明显低于同龄健康人群,TRECs可用于CHB患者胸腺功能的评估。

检测T细胞受体重排切除环的意义及应用研究

T细胞受体重排切除环是T细胞受体基因重排过程中切除的DNA环 ,可作为新近从胸腺迁出者的标记 ,应用于胸腺功能的评价。近年来由于免疫重建研究的缘故 ,检测T细胞受体切除环受到了重视。本文拟从T细胞受体切除环产生及应用的意义、方法上作一综述。

造血干细胞移植后免疫重建早期T细胞受体删除环的检测分析

背景:目前对于造血干细胞移植后的免疫监测缺乏直接明确的检测指标,利用不断改良的实时定量荧光PCR技术监测T细胞受体删除环(T-cell receptor excision circle,TREC或signal joint T-cell receptor excision circle,sjTREC)拷贝数来反映胸腺新近功能,从而评估免疫重建水平,指导预后治疗。目的:检测造血干细胞移植患者免疫重建早期T细胞受体删除环水平,分析移植方式、年龄、疾病类型、性别等因素的影响。方法:采用Taq Man探针,实时定量荧光PCR技术检测29例健康正常人,19例造血干细胞移植前患者,6例造血干细胞移植后患者的外周血1 000个细胞中所含sjTREC拷贝数。结果与结论:(1)正常对照组1 000个细胞中所含sjTREC拷贝数为26.99±29.3,随年龄增加而降低,男女性别sjTREC水平无明显差异;患者组移植前sjTREC水平低于正常对照组且差异有显著性意义(P=0.006);(2)6例患者移植后1个月时sj TREC水平上升,移植后6个月时sjTREC水平下降;(3)移植后6个月时2例HLA半相合亲缘移植与4例HLA全相合非亲缘移植患者sjTREC水平接近;(4)结果表明,移植前患者胸腺功能严重受损,在移植后1个月出现短暂上升后下降的趋势可能与胸腺应激性反应相关;亲缘与非亲缘移植、男性与女性、不同年龄患者等单因素分析未见明显差异,但移植后sjTREC水平上升反映了移植后胸腺新近输出功能的变化,体现了免疫重建受多种因素的影响。

外周血T细胞受体删除环(TRECs)定量测定在评估骨髓移植术后免疫重建中的应用概况及进展

骨髓移植成功的关键在于移植后免疫系统的重建状况,特别是T细胞数量及功能的重建。T细胞受体删除环(TRECs)作为胸腺近期输出naive T细胞含量的标志,在细胞中十分稳定,可作为评价胸腺近期的输出功能及T细胞免疫重建状况的指标。鉴于TRECs对评价骨髓移植术后免疫重建状况具有重要现实意义,该文就TRECs的定量检测及其在评价骨髓移植后免疫重建状况中的应用概况及进展进行综述。

荧光定量PCR检测T细胞受体删除环在亲缘与非亲缘异基因造血干细胞移植后免疫重建早期的应用

目的检测接受亲缘与非亲缘的异基因造血干细胞移植(allogeneic hemopoietic stem cell transplant,alloHSCT)的恶性血液病患者免疫重建早期T细胞受体删除环(signal joint T-cell receptor excision circle,sjTREC)的水平,分析供受者间亲缘关系对免疫重建早期的影响。方法采用TaqMan探针,Real-Time PCR技术,对6例(2例亲缘,4例非亲缘)allo-HSCT恶性血液病患者在移植前及移植后6个月的外周血sjTREC进行绝对定量检测。结果每1 000个细胞中各组sjTREC水平分别为:亲缘组移植前(17.05±22.28)拷贝,移植后(24.26±25.50)拷贝;非亲缘组移植前(6.74±12.85)拷贝,移植后(28.30±19.12)拷贝。结论两组患者移植后的sjTREC水平较移植前均有所上升,但无论移植前后两组之间的差异均不明显,提示在allo-HSCT患者移植后的免疫重建受诸多因素共同影响,供者是否具有亲缘关系在小样本检测中未发现明显差异。

T细胞受体Dβ-Jβ sjTRECs连接区多样性

目的 了解T细胞受体Dβ Jβ重排形成的T细胞受体删除DNA环 (sjTRECs)连接区序列特点。 方法 利用巢式PCR分别扩增 10例正常人外周血单个核细胞和 3例正常胸腺细胞DNA中不同的Dβ片段和Jβ重排时形成的TRECs的情况 ,PCR产物进一步进行克隆和序列分析以确定结合区的序列。结果 获得Dβ1与 5个Jβ1基因片段、Dβ2与 4个Jβ2基因片段分别形成的sjTRECs连接区序列 ,部分所形成sjTRECs的Jβ与Dβ之间存在核苷酸的随机插入 (N区 )等多样性。结论 Dβ JβsjTRECs的连接并非简单的头对头拼接方式 。

重度苯中毒患者T细胞受体Vβ亚家族TRECs的分析

目的检测重度苯中毒患者外周血23个TCRVβ-Dβ1TRECs的存在情况,进一步了解重度苯中毒患者胸腺近期各Vβ亚家族初始T细胞的输出情况。方法分别在5×104和1×104个外周血单个核细胞水平下,采用半巢式对12例重度苯中毒患者和10例正常人的23个TCRVβ-Dβ1TRECs进行扩增。结果在5×104和1×104细胞水平下,苯中毒组检出各TCRVβ-Dβ1TRECs数均显著低于对照组(P<0.05)。在5×104细胞水平时,对照组检测到23个TCRVβ-Dβ1TRECs,苯中毒组仅检测到17个TCRVβ-Dβ1TRECs,其中12个TCRVβ-Dβ1TRECs检出率与对照组相比明显降低(P<0.05)。结论本研究提供了苯中毒患者外周血中各TCRVβ-Dβ1TRECs存在情况。苯中毒患者TCRVβ-Dβ1TRECs检出数量和检出率低于正常人,提示重度苯中毒患者胸腺近期输出功能存在部分缺陷和低下的情况。

苯致血液、免疫毒性及T细胞受体分析在接苯人群中的应用

苯是一种应用广泛的化学物质,长期接触可引起白血病。本文就苯的血液和免疫毒性及其机制,T细胞受体相关分析在接苯人群中的应用情况进行综述。

苯中毒患者胸腺近期输出功能和T细胞亚群变化

目的 分析职业性慢性轻度苯中毒工人外周血单个核细胞中信号结合T细胞受体删除DNA环 (sjTRECs)的含量和CD4+/CD8+比值 ,从而了解其初始 (naive)T细胞含量和胸腺近期输功能 ,以及外周T细胞亚群分布情况。方法 利用间接免疫荧光法检测 11例健康人和 5例轻度苯中毒患者外周血单个核细胞中CD4+/CD8+比值 ;采用实时荧光定量聚合酶链反应 (real timePCR)和TaqMan方法检测两组外周血单个核细胞中sjTRECs的含量。结果 每 10 0 0个外周血单个核细胞中sjTRECs含量在正常人中为 9 10± 4 5 5 ,轻度苯中毒为 2 80± 3 79,P <0 0 5 ;轻度苯中毒者CD4+/CD8+的比值 (0 92± 0 3 5 )明显低于正常人 (1 49± 0 2 1) ,P <0 0 1。结论 轻度苯中毒患者胸腺近期输出功能低下 。

接苯工人胸腺近期输出功能和外周血T细胞亚群变化

目的分析接苯工人外周血单个核细胞中T细胞受体删除DNA环(TRECs)和T淋巴细胞亚群的含量,了解接苯后工人胸腺近期输出功能和外周T淋巴细胞亚群变化,为接苯后机体细胞免疫改变提供资料。方法利用间接免疫荧光法检测健康人和接苯工人外周血单个核细胞中CD3+,CD4+,CD8+的含量;采用实时荧光定量聚合酶链反应(real time PCR)和TaqMan方法检测标本外周血单个核细胞中TRECs的含量。结果在接苯工人外周血白细胞总数正常情况下,接苯组CD8+含量显著增加,CD4+/CD8+比值为(1.13±0.78),低于健康人(1.43±0.25)(P<0.05)。每1000个外周血单个核细胞中接苯组与对照组TRECs含量分别为(3.90±3.58)和(7.39±6.83),两者相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论长期低剂量接苯可能引起一些工人的胸腺近期输出功能低下,导致机体细胞免疫功能障碍。

实时定量PCR检测小鼠成熟过程中T淋巴细胞sjTRECs水平

目的:实时定量PCR检测正常小鼠成熟过程中胸腺及脾脏T淋巴细胞的信号结合T细胞受体重排删除DNA环(sjTRECs)含量,从而推测T淋巴细胞中的初始T细胞的数目,评价小鼠成熟过程中的胸腺功能.为胸腺发育和功能研究及胸腺研究模型的建立提供研究依据和方法.方法:实时定量PCR(SYBRGreen法)检测T淋巴细胞中sjTRECs含量.结果:1～6wk的小鼠胸腺中的初始T细胞含量持续增加,9wk时已经开始下降,12wk时持续下降.而小鼠的外周中初始T细胞的含量则随着周龄增加而增加(1～12wk).结论:在小鼠的成熟过程中,从9wk开始胸腺的生成功能减弱,而胸腺的输出功能持续增加;成功建立和应用实时定量PCR检测小鼠T淋巴细胞中sjTRECs含量,是准确评价小鼠胸腺功能的方法.

急性髓性白血病患者异基因造血干细胞移植后早期T细胞免疫重建的研究

目的:监测急性髓性白血病(AML)患者接受异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后外周血中的T细胞受体重排删除环(TRECs)水平,了解移植后早期的T细胞免疫重建情况。方法:AML患者15例分别在allo-HSCT前以及allo-HSCT后每隔2周收集外周血,采用实时定量PCR法检测外周血单个核细胞(PBMNCs)中的TRECs水平;7例年龄相近的正常人外周血样本作为对照。流式检测CD45RA+细胞亚群和CD45RO+细胞亚群的阳性率。结果:allo-HSCT组移植前的TRECs平均拷贝数为(1.42±1.51)拷贝/1000 PBMNCs,明显低于正常组的(3.03±0.45)拷贝/1000 PBMNCs水平;移植后第12周的TRECs平均拷贝数为(1.67±1.93)拷贝/1000 PBMNCs,与正常相比仍然较低。移植后8周内以CD45RO+/CD4+细胞的扩增为主,而外周血TRECs水平在allo-HSCT后4周左右出现短暂地升高趋势,随后又下降,至allo-HSCT8周后才开始稳步上升。有急性移植物抗宿主病(aGVHD)病史的移植患者的外周血TRECs水平显著降低,明显低于无aGVHD病史移植患者的外周血TRECs水平。3例移植后早期复发的患者的外周血TRECs水平降至基线水平或检测不到。结论:不同个体T细胞免疫重建时间存在差异;AML患者在allo-HSCT后早期(90d内)的胸腺输出功能仍处于恢复阶段,移植后4周内的免疫重建仍以来源于供者细胞的外周扩增为主;外周血TRECs水平可能与AML患者allo-HSCT后病情的发展、转归有关。

B-ALL患者胸腺输出TCR Vβ亚家族nave T细胞分析

目的了解B细胞-急性淋巴细胞白血病（B-ALL）患者外周血T细胞TCR Vβ亚家族23种信号T细胞受体删除DNA环（sjTRECs）的存在情况，从而了解胸腺近期输出各TCR Vβ亚家族naive T细胞的功能。方法利用半巢式PCR分别扩增10例B-ALL患者外周血单个核细胞DNA中的23种Vβ～Dβ1 sjTRECs，10例正常人作为对照。结果TCR Vβ亚家族sjTRECs在大部分正常人和部分B-ALL患者中均可检测到，与正常人比较，B-ALL病人的Vβ24～Dβ1 sjTRECs出现频率比正常人高，且有统计学意义（80％：30％，P=0．0285），另有18个家族的Vβ～Dβ1 sjTRECs比正常人低，其中在Vβ1（30％，P=0．0285）、Vβ12（20％，P＝0．0285）、Vβ13（40％，P=0．0043）、Vβ15（20％，P=0．0022）和Vβ18（20％，P=0．0089）5个亚家族sjTRECs出现频率的差异有统计学意义。结论B-ALL病人胸腺输出大多数Vβ亚家族naive T细胞功能低于正常人。

T细胞受体重排删除环定量检测及其在慢性乙型肝炎中的应用

在临床实践中获取胸腺组织来了解胸腺功能变化并不现实。因此，胸腺功能的评估通常使用能够反映胸腺近期输出功能的间接指标。外周血T细胞受体重排删除环（Tcellreceptorrearrangementexcisioncircles。TRECs）及幼稚T淋巴细胞是评估胸腺近期输出功能的最常用的间接指标，外周血TRECs定量分析已用于一些疾病胸腺近期输出功能和免疫重建的评价。现对TRECs定量检测及其在慢性乙型肝炎中的应用进行综述。

TCRγV_1/pcDNA3重组质粒的构建

目的:构建含TCRγV1重排基因的真核表达质粒。方法:从人淋巴瘤Jurkat细胞中提取mRNA,用RT-PCR法扩增含BamH与Hind酶切位点TCRγV1基因序列,对pcDNA3载体及TCRγV1基因PCR产物经双酶切,用连接酶将两者连接并转化到大肠杆菌DH5a,对重组质粒经序列测定,称pcDNA3/TCRγV1。结果:电泳获得333bp的TCRγV1预期条带。结论:该条带测序证实为TCRγV1基因序列。

胸腺输出及sjTRECs与移植后 T 细胞免疫重建

异基因造血干细胞移植后受者免疫功能的重建与 T 细胞功能重建关系密切，信号 结合 T 细胞受体删除 DNA 环(sjTRECs)反映胸腺输出功能，与 T 细胞免疫重建相关。分 析移植的预处理方案及免疫抑制剂处理对 sjTRECs 的影响，有助于探讨移植后免疫重建 的新策略。

儿童急性淋巴细胞白血病T细胞受体重排删除环与严重感染相关性研究

目的定量检测急性淋巴细胞白血病(急淋)患儿不同阶段外周血中信号连接/结合T细胞受体重排删除环(sjTRECs)水平的变化,以评价其作为预测化疗后严重感染指标的可行性。方法共收集初发急淋患儿(初发组,n=30)、早期强化化疗结束后白细胞恢复且未感染患儿(化疗组,n=36)、化疗后严重感染患儿(感染组,n=30)及正常同龄儿童(正常组,n=50)外周血标本共146份,通过FQ-PCR法检测其sjTRECs水平,并进行组间比较。结果正常组平均sjTRECs为(394±270)copies/103 MNC,高于其他3组(P<0.05);化疗组sjTRECs水平低于初发组[(96±78)copies/103 MNC vs(210±219)copies/103 MNC,P<0.05];感染组sjTRECs水平最低,仅为(48±40)copies/103 MNC。结论监测急淋患儿化疗后sjTRECs水平变化可能有助于早期预测机体严重感染的发生。