T细胞受体(TCR)组库多样性及其在肺癌防治中的应用进展

免疫检查点抑制剂已成为晚期肺癌的标准治疗,但在转移防治中尚无明确突破。T细胞受体(TCR)是识别癌细胞表面新生抗原的关键“信号感受器”,我们从TCR组库多样性及其识别肿瘤抗原机制的角度,总结了基因工程编辑的T细胞受体T(TCR-T)细胞疗法在肺癌防治中的研究进展,以期提高肺癌转移防治疗效。

自身免疫模型小鼠T细胞受体可变区β链(TCR Vβ)偏向取用研究进展

T细胞是机体的主要免疫细胞,且在适应性免疫中起到主要作用。而T细胞受体(TCR)是T细胞表面特异性受体,是识别抗原的主要部位;TCR具有多样性和特异性,其中,最具多样性的是T细胞受体β链可变区(TCR Vβ),TCR Vβ的研究可为临床疾病的诊断和治疗提供新的思路和方向。TCR Vβ家族在各种疾病的动物模型的研究中具有重要的意义和应用价值,本文将对Vβ亚家族偏向取用在小鼠模型中的研究进展进行综述。

T细胞受体(TCR)库及其高通量测序常用分析工具

T细胞受体(TCR)是T细胞识别抗原的关键部分,个体中所有的TCR总和称为TCR库。研究机体健康或患病状态下TCR库的组成及特征有助于我们更好地理解适应性免疫。目前已有大量针对高通量数据的分析工具,分析内容包括基本组成分析和下游功能分析等。抗原特异性T细胞数据库的建立为临床研究提供基础,对TCR库功能特征的分析是重点与难点,但现阶段已发布的下游分析工具还有待更多的实践与验证。我们总结了几种常用的TCR库分析工具,为非生物信息专业的科研人员选择分析工具提供参考。

急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8^+ T细胞受体α和β链亚家族特点

目的:分析急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8+ T细胞受体α和β链亚家族特点。方法:从1例HLA*0201的急性乙型肝炎患者的外周血分离外周血单个核细胞(PBMC),用乙肝抗原HBsAg表位S335-343多肽和细胞因子刺激PBMC以诱导CD8+ T增殖,用流式细胞仪分选出特异性CTL到96孔培养板,培养10～14 d后,提取细胞RNA,PolyA介导反转录,巢式PCR扩增TCR Vα和TCR Vβ,并用非特异性CD8+ T细胞作为对照。对扩增产物分别进行直接测序和克隆测序分析。结果:从HBV急性肝炎患者分离的HBsAg335-343表位特异性CD8+ T细胞扩增出15个Vα亚家族和10个Vβ亚家族,其中用少量CTL仅检出Vα2、Vα9和TCR Vβ3、Vβ4、Vβ9,提示这几种亚家族可能为该特异性CTL TCR的优势取用亚家族,除Vα2呈现3种序列和Vβ9呈现2种序列外,其他亚家族内序列单一;而从患者非特异性CD8+ T对照细胞中可扩增到所有的32个TCRVα和25个Vβ亚家族,且同一亚家族序列呈现高度多样性。结论:急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8+ T细胞受体存在优势利用的特点,可能是由于针对同一抗原的特异性CD8+ T细胞克隆性增殖所致,其机制有待进一步分析。

一种高效扩增人T细胞受体β链可变区基因的方法建立

目的:建立一种高效扩增人T细胞受体(TCR)β链可变区(Vβ)基因的方法。方法:根据TCRVβ26个亚家族基因序列特点设计扩增Vβ基因的上游内引物34条、上游外引物37条,并将内、外上游引物各分为8个简并组。在恒定区(C区)设计下游内、外和测序引物各1条以及扩增Cβ基因的上游引物1条。提取细胞RNA,用PolyA介导反转录后,采用巢式PCR扩增正常人CD8T细胞TCRVβ26个亚家族基因,并用JurkatT淋巴瘤细胞作为对照。用T-easy载体克隆RT-PCR产物,对克隆基因进行测序。结果:从正常人的CD8T细胞中扩增到所有TCRVβ亚家族基因,克隆后测序与相应的参考序列同源。从Jurkat细胞扩增出TCRVβ8基因,经测序验证与文献报道一致,且最少可从10个细胞提取的RNA模板中扩增成功。结论:建立的巢式RT-PCR方法可以高效、广谱地扩增人TCRVβ基因,为进一步进行抗原特异性细胞毒T淋巴细胞的TCR克隆和功能研究打下了良好基础。

TRGV及预后相关趋化因子/受体基因在T细胞淋巴瘤中的表达变化

目的分析非γδ T细胞型的T细胞淋巴瘤患者外周血中T细胞受体γ(TCR γ)亚家族可变区Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(TRGVⅠ、Ⅱ、Ⅲ)基因和预后相关趋化因子及其受体基因(CCL20、CCR6、CCL17、CCL22以及CCR4)的表达情况,探讨γδ T细胞与趋化因子/受体表达的相关性及其与疾病转归的相关性。方法收集27例非γδ T细胞型的T细胞淋巴瘤患者外周血样本,同时收集9例健康志愿者外周血样本作为对照。采用荧光实时定量PCR检测T细胞淋巴瘤患者以及正常人外周血中TRGVⅠ~Ⅲ亚家族基因以及CCL20/CCR6、CCL17/CCL22/CCR4基因的表达水平。结果初发组、难治复发组和缓解组的TRGVⅠ~Ⅲ亚家族的表达水平与正常组相比均有不同程度的增高,且TRGV亚家族表达模式发生改变。初发组和难治复发组的CCL22和CCR4的表达水平显著高于正常组,而CCL17表达水平显著低于正常组。初发、缓解和难治复发组的患者外周血中TRGV各亚家族基因与各趋化因子及受体基因表达水平的相关性模式也发生改变。初发组和难治复发组存在低表达的TRGVⅡ亚家族,治疗缓解后TRGVⅡ亚家族的表达升高。结论 TRGVⅡ亚家族可能是抗T细胞淋巴瘤的T细胞功能亚群,可能与疾病的发病和转归相关。T细胞淋巴瘤中高表达水平的CCL22/CCR4,可能与疾病的发病有关。

T淋巴瘤EL-4细胞双受体表达研究

目的:检测T淋巴瘤EL-4细胞T细胞受体(T cell receptor,TCR)的表达情况,为进一步研究T细胞等位基因排斥机制奠定基础。方法:以小鼠脾细胞作为阳性对照,分别提取脾细胞和EL-4细胞mRNA,逆转录为cDNA,RT-PCR扩增24个TCR BV家族CDR3区,结合基因扫描(GeneScan)和基因测序技术,对有表达的TCR BV家族进行CDR3谱型和序列分析。结果:小鼠脾细胞24 BV家族均有表达,各TCR BV家族CDR3谱型均呈高斯分布(Gaussian distribution),表明24 BV家族均为多克隆性。EL-4细胞被同时检测到TCR BV10和BV12家族表达,CDR3谱型均呈单峰,两个家族的RT-PCR产物经测序鉴定证实确属TCR序列,且均为框内编码。结论:EL-4细胞存在两套框内重排的TCRβ链,表明其TCRβ链可能存在等位基因排斥"缺陷"现象。本研究为探索T细胞等位基因排斥机制奠定了基础。

T细胞受体Vβ亚家族基因表达特点与特发性血小板减少性紫癜临床疗效的相关性

目的研究特发性血小板减少性紫癫（ITP）患者T细胞受体p链可变区互补决定区3（TCRβVCDR3）基因表达的变化，与ITP临床治疗效果之间的关系。方法采用RT—PCR方法分析15例缓解组ITP患者、10例复发难治组ITP患者和6例正常对照组T细胞受体β链（TCRβ）的可变区（V）的24个家族的互补决定区3（CDR3）基因序列。结果15例缓解组ITP患者见部分CDR3基因谱型异常，平均每个患者基因异常的家族数为2．55±0．38个，未见T细胞克隆增生。10例复发难治组ITP患者中，在8V8、BV13．1、BV14和BV17等亚家族都出现了克隆性增生，平均每个患者异常家族为7．1±3．15个，明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论ITP的发病及预后与T细胞免疫状态有关，TCRBVCRD3基因谱型分析可以发现异常增生克隆，有助于判断ITP的治疗效果和预后。

鸡T细胞受体γ链基因位点重新测序和组装

动物T细胞受体(T cell receptor,TCR)基因由多个不同的高度同源的基因家族组成,通过全基因组测序很难获得准确的基因序列和排列位置。文章通过在NCBI中发布的鸡TCR的γ链(TCRγ或TRG)基因片段序列定位了鸡TRG基因所在区域,并确定了与鸡TRG基因位点对应的细菌人工染色体(BAC)克隆(CH261-174P24)。对该克隆进行高通量的重新测序和组装后,得到含有10个scaffolds的基因组草图,较完整地覆盖了鸡TRG基因位点及两侧区域。通过PCR扩增和测序证明了scaffold内部结构的正确性,校正了鸡参考基因组TRG基因位点一个可变基因和一个缺口序列(gap)附近各一处错误序列,以及可变基因区多处序列错误。文章通过校正鸡参考基因组TRG基因位点的序列,为鸡TRA/D和TRB基因位点的基因组序列分析提供了新方法。

γδT细胞及其受体多样性的研究进展

γδT细胞亚群的数量、分布等对于疾病具有显著影响,在多数疾病中通过免疫调节发挥保护作用,其T细胞表面受体(TCR)可变区基因具有多样化潜能。在γδT细胞发育过程中,γδTCR通过重组活化基因(RAG)蛋白调控的V(D)J重排机制产生,多个不连续功能性的V、D、J基因片段重排(重组多样性)和核苷酸的随机插入与剪切(连接多样性)是形成其基因多样性的主要机制。Vγ-Jγ重组决定不同部位的γδT细胞亚群种类的分布,Cγ家族的细胞因子也参与Vγ-Jγ重组编码上皮内淋巴细胞的γδTCR、参与构成次级淋巴器官中的不同的γδTCR。我们主要从γδTCR产生的V(D)J重排机制、重组多样性以及γδT细胞亚群及基因的优势表达在肿瘤、感染和自身免疫性疾病中的保护性免疫作用和致病性免疫作用的相关研究进行总结,将有助于我们更全面地理解疾病的发生发展。

免疫检查点治疗对T细胞受体库的影响

T细胞受体(TCR)是机体适应性免疫应答的关键,而免疫检查点是肿瘤治疗的重大突破,细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)和程序性死亡蛋白1(PD-1)与TCR的关系是近年研究热点, TCR库的克隆多样性、 CDR3长度、空间异质性在免疫检查点的治疗中表现出一定的特征,我们主要总结了免疫检查点治疗对TCR库的影响以及TCR库用于肿瘤治疗的相关研究进展。

T淋巴细胞受体与多发性硬化

免疫性T淋巴细胞在多发性硬化(MS)的发病中有重要地位,国外关于MS患者T淋巴细胞受体β链可变区的研究显示MS患者T淋巴细胞受体β链可变区的某些区段会有克隆性扩增,并且与临床类型、病程、MRI表现、扩展残疾状态评分有一定关系。本文就MS患者T淋巴细胞受体β链可变区的表现进行综述。

PDIA3对人Jurkat T细胞TCR信号通路的调控

为了研究蛋白质二硫键异构酶A3前体(protein disulfide isomerase A3 precursor,PDIA3)在T细胞受体(T cell receptor,TCR)信号通路中的具体功能,利用电穿孔法将T细胞内的PDIA3蛋白水平敲低,通过Western blotting检测ζ-链相关蛋白70(zeta-chain associated protein 70,ZAP70)的磷酸化修饰水平,酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)实验检测细胞因子IL-2的分泌情况,流式细胞术分析分化抗原簇69(cluster of differentiation 69,CD69)表达水平及荧光素酶报告基因检测NF-κB信号通路.结果显示:T细胞中PDIA3蛋白下调后导致ZAP70蛋白的磷酸化水平、CD69表达和IL-2的分泌都明显降低,并且影响了NF-κB信号通路,表明PDIA3蛋白对T细胞的活化有促进作用,参与T细胞TCR信号通路的调控,为进一步深入研究PDIA3与TCR下游一些功能蛋白的相互作用打下了基础.

透骨血竭散外敷对类风湿性关节炎大鼠T细胞抗原受体通路中Lck、Fyn蛋白表达及滑膜细胞凋亡的影响

【目的】探讨透骨血竭散外敷对类风湿性关节炎(RA)大鼠的治疗作用及机制。【方法】将44只大鼠随机分为假手术组、模型组、透骨血竭散组及扶他林组,每组11只。除假手术组外,其余各组大鼠构建RA模型。建模成功后,次日透骨血竭散组大鼠于左后足足跖部及踝关节外敷透骨血竭散,扶他林组相同部位外敷扶他林软膏,模型组及假手术组相同部位外敷空白凝胶膏剂。采用足容积测量仪测量大鼠左后足的肿胀体积;苏木素-伊红(HE)染色法观察踝关节病理形态并进行炎症细胞浸润评分;末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的d UTP缺口末端标记(TUNEL)法测定滑膜细胞凋亡;蛋白免疫印迹法检测踝关节组织T细胞抗原受体(TCR)通路中Lck、Fyn蛋白表达;免疫组织化学法检测踝关节滑膜组织Bax、Bcl-2阳性表达。【结果】与假手术组比较,模型组大鼠足爪肿胀度升高,踝关节组织呈现明显RA病理改变,且炎症细胞浸润评分升高,踝关节组织Lck、Fyn蛋白表达水平升高,滑膜组织Bcl-2阳性细胞比率升高、Bax阳性细胞比率降低(均P<0.05);与模型组比较,透骨血竭散组及扶他林组的足爪肿胀度降低,踝关节组织病理损伤改善,且炎症细胞浸润评分降低,踝关节组织Lck、Fyn蛋白表达水平降低,滑膜组织Bcl-2阳性细胞比率降低、Bax阳性细胞比率升高(均P<0.05);透骨血竭散组各指标的改善效果优于扶他林组(均P<0.05)。【结论】透骨血竭散外敷可改善RA大鼠踝关节的肿胀,其机制可能与抑制TCR信号通路Lck、Fyn蛋白表达,抑制炎症细胞浸润,促滑膜细胞凋亡有关。

高通量测序分析脓毒症患者早期T细胞抗原受体β链CDR3的组成及多态性

目的 采用高通量测序的方法探讨脓毒症患者早期T细胞抗原受体（TCR）β链互补决定区3（CDR3）的组成及多态性。 方法 从深圳市人民医院重症医学科收集脓毒症患者6例，从体检科收集年龄匹配的对照患者9例，入科后留取其静脉血，分离外周血单核细胞并提取DNA，对TCR β链CDR3进行多重PCR扩增，然后对产物进行高通量测序及数据分析。 结果 脓毒症组（S组）和对照组（N组）的TCR β链CDR3长度呈高斯分布，且两组前60种特有核苷酸序列和特有氨基酸表达水平存在很大差异；针对TRβV片段59个基因的表达水平进行比较，其中TRBV 10-2、TRBV 10-3、TRBV 12-1、TRBV 5-7的表达水平差异有统计学意义（P＜0.05）；对TRβJ片段中的14个基因的表达水平进行了F检验，其中TRBJ 1-1、TRBJ 1-2、TRBJ 2-1、TRBJ 2-5的表达水平差异有统计学意义（P＜0.05）。 结论 脓毒症患者早期T细胞TCR β链CDR3的多态性发生了明显改变，提示其与脓毒症的免疫发病机制有关，这将为脓毒症的发病机制研究、治疗和预后的判断提供新的方法和手段。

T细胞过继免疫治疗法在肿瘤疾病治疗中的应用进展

目前T细胞过继免疫治疗技术已应用于治疗各种疾病,尤其是在肿瘤领域的应用,具有肿瘤抗原特异性的T细胞过继免疫疗法不仅可以在体外实验中诱导肿瘤细胞死亡,而且已经部分应用于临床患者并达到一定的治疗效果,有望成为从基因水平上解决肿瘤疾病的前沿武器。本文对近年来T细胞过继免疫疗法在肿瘤疾病治疗方面的研究进行综述。

G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白2(GIT2)参与免疫调控的研究进展

G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白2(GIT2)是一类多结构域的信号支架蛋白。GIT2通过与不同蛋白质的相互作用调节细胞功能,主要参与整合素介导的细胞黏附、肌动蛋白细胞骨架组装以及胞内信号传递过程。GIT2在免疫系统中也扮演着重要角色,促进中性粒细胞趋化性,抑制其过度产生超氧化物,促进胸腺细胞的阳性选择和趋化性,抑制炎症性肠病,介导肝脏免疫性损伤,且GIT2敲除小鼠具有多种免疫缺陷症状。本文简述了GIT2在免疫体系中的调控作用。

含锌指和BTB结构域7B(ZBTB7B/ThPOK)及其相关因子在T细胞分化及功能中的作用

含锌指和BTB结构域7B(ZBTB7B/ThPOK)是CD4谱系分化中的关键转录因子,并抑制CD8谱系生成。ThPOK蛋白表达促进CD4谱系分化,维持CD4谱系稳定性,并抑制CD8谱系分化。首先在胸腺内,ThPOK基因表达受T细胞受体(TCR)信号、基因增强子、基因沉默子等调节,且ThPOK表达受GATA结合蛋白3(GATA3)、Runt相关转录因子3(Runx3)、白血病/淋巴瘤相关因子(LRF)、胸腺细胞选择相关性高迁移率族盒基因(TOX)、Myc关联的锌指蛋白相关因子(MAZR)、E1A结合蛋白p300(P300)等转录因子影响,进而影响CD4、CD8谱系分化。而在外周T细胞中,ThPOK影响CD_4^+T细胞亚群、CD_8^+T细胞分化及功能。在此基础上,正逐步展开针对外周疾病中ThPOK作用的研究。

抗原特异性T细胞检测技术研究的进展

抗原特异性T细胞在细胞免疫应答中发挥着核心作用,而细胞免疫在清除病毒感染以及肿瘤的过程中又起关键作用。因此,对于抗原特异性T淋巴细胞的检测可为机体细胞免疫功能的评价提供重要信息。我们从表型到功能对抗原特异性T淋巴细胞的检测技术进行简要概述。总体而言,相关的技术平台与方法正在朝着高通量和动态性的方向发展,无论对于基础研究或者药物筛选都具有极大的促进作用。

HLA-I限制性CTL表位改造的研究进展

内源性抗原被宿主的APC类细胞加工及提呈后,以抗原肽-MHC-I类分子复合物的形式表达于细胞表面,供特异性CD8+T细胞识别。然而,一些天然CTL表位与MHC-I的亲和力较弱,也容易引起机体的免疫耐受,并且在体内易受蛋白酶的攻击水解。针对这些不足,国内外许多学者采用了不同的方法对天然CTL表位进行改造。本文就近些年来天然CTL表位改造的主要方法做一简单的综述。