急性白血病KG1a细胞抗原对外周血单个核细胞杀伤活性和T细胞受体VαβT细胞增殖的影响

目的研究急性白血病KG1a细胞抗原体外诱导人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)的杀伤活性和T细胞受体Vαβ谱系的表达和克隆情况。方法应用制备的急性白血病细胞KG1a抗原和外周血单个核细胞混合培养,LDH释放法检测诱导前后PBMC杀伤KG1a细胞活性,RT-PCR扩增诱导前后T细胞的TCR Vαβ亚家族的CDR3,并用基因扫描分析T细胞受体Vαβ谱系的表达情况。结果经KG1a细胞抗原诱导后PBMC细胞杀伤活性增强,在不同效靶比时诱导前后的杀伤率差异有统计学意义(P<0.05),且随效靶比增加而增加;CD8^+T淋巴细胞比例显著提高(P<0.05)。诱导后T细胞出现单克隆趋势、单克隆及寡克隆,某些亚家族甚至消失。结论KG1a细胞抗原体外可诱导T细胞呈克隆性增殖,具有特异性细胞毒作用,能提高对KG1a细胞的杀伤活性。

和解汤对慢性乙型肝炎T细胞受体Vβ7基因表达的影响

目的:探讨和解汤对慢性乙型肝炎（简称慢乙肝）临床疗效与T细胞受体Vβ7（TCRVβ7）基因表达特征的相关性。方法:将慢乙肝患者45例随机分为两组,治疗组（30例）采用和解汤治疗,对照组（15例）采用常规西药治疗,观察治疗后TCRVβ7,基因表达变化。结果:经过6个月治疗,两组ALT水平均显著下降（P<0.01）,治疗组5例测出TCRVβ7,基因表达,并均出现HBV-DNA、HBeAg阴转;对照组无一例测出TCRVβ7基因表达,无一例出现HBV-DNA、HBeAg阴转。HBV-DNA、HBeAg未阴转的患者,虽肝功能恢复正常,但无一例测出TCRVβ7基因表达。两组总有效率比较差异无显著性,但两组显效率比较差异有显著性（P<0.01）。结论:和解汤对TCRVβ7基因表达有调节作用,可能是抑制病毒复制、清除病毒的重要途径。

非小细胞肺癌患者T细胞受体Vβ表达和克隆性研究

目的 了解非小细胞肺癌 (non small celllungcancer ,NSCLC)患者外周血淋巴细胞 (PBL)、肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)及非癌肺组织淋巴细胞中T细胞受体 (TCR)Vβ优势表达情况及优势亚家族的克隆性分布。方法 收集 2 4例NSCLC患者外周血、肺癌组织和非癌肺组织 ,提取RNA ,经反转录多聚酶链反应 (RT PCR) ,扩增TCRVβ 2 4个亚家族基因的互补决定区 3(CDR3) ,PCR产物进一步经基因扫描分析 ,以 10例正常人外周血结果作对照 ,比较不同来源T细胞TCRVβ亚家族的表达情况。 结果 NSCLC患者仅存在部分亚家族的T细胞 ,其中TCRVβ5的表达率在TIL中 (6/18,33.3% )明显高于PBL(1/2 4,4.2 % )和非癌肺组织(0 /12 ) ,P值均 <0 .0 5 ,而且 6例表达Vβ5的TIL中 2例为寡克隆增殖 ,4例为多克隆增殖。 结论 NSCLC患者TCRVβ 2 4个亚家族呈倾斜性分布和克隆性增殖 ,提示NSCLC的TIL中可能存在肿瘤相关抗原 (TAA)

大鼠T细胞受体Vβ5.2-HSP70和Vβ8.2-HSP70基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建含大鼠TCR Vβ5.2-HSP70和TCR Vβ8.2-HSP70基因的重组真核表达质粒,并检测其在体内外的表达。方法:实验于2005-10/2006-09在首都医科大学免疫学系实验室完成。①以自主构建的重组表达载体pTARGET-TCR Vβ5.2和pTARGET-TCR Vβ8.2为模板,将结核杆菌HSP70的一段保守序列P111-125设计到引物中,通过PCR的方法得到TCR Vβ5.2-HSP70和TCR Vβ8.2-HSP70基因片段,将其插入到真核表达载体pTARGET中,构建重组表达载体pTARGET-TCR Vβ5.2/8.2-HSP70。②将BALB/c小鼠48只随机分为4组,pTARGET-TCR Vβ 5.2-HSP70组、pTARGET-TCR Vβ8.2-HSP70组和空质粒组肌注相应的质粒DNA100μg/次,PBS组注射PBS缓冲液100μL/次。共注射3次,每次间隔2周。于末次免疫后3d取注射部位的肌肉,用RT-PCR及免疫组化染色法检测TCR Vβ5.2/8.2-HSP70基因在注射部位的转录和表达。③将COS-7细胞分为pTARGET-TCR Vβ5.2-HSP70组、pTARGET-TCR Vβ8.2-HSP70组、空质粒组和未转染细胞组,进行相应质粒转染,24h后收集细胞,用免疫细胞化学染色法检测靶基因在真核细胞内的表达。结果:①TCR Vβ5.2/8.2-HSP70基因已被正确插入到pTARGET载体中。②pTARGET-TCR Vβ5.2-HSP70组、pTARGET-TCR Vβ8.2-HSP70组小鼠免疫处的肌肉组织RT-PCR检测显示,在500～600bp和400～500bp处出现特异的扩增带,分别与TCR Vβ5.2-HSP70和TCR Vβ8.2-HSP70基因片段的大小相符,而注射空质粒组和PBS组均未见此条带。③免疫组化结果显示转染重组质粒pTARGET-TCR Vβ5.2/8.2-HSP70的COS-7细胞的胞质及胞膜都有明显的着染。结论:成功构建了重组真核表达质粒pTARGET-TCR Vβ5.2/8.2-HSP70,并在体内外检测到其转录和表达,为进一步进行TCR DNA疫苗治疗胶原诱导性关节炎的实验研究奠定了基础。

T细胞受体Vβ基因谱系分析在血液肿瘤研究中的应用

分析T细胞受体(TCR)Vβ基因谱和CDR3长度可以确切了解TCR Vβ亚家族T细胞的表达和克隆性。目前TCR Vβ基因谱分析已广泛应用于判断血液肿瘤和免疫相关疾病患者的免疫功能状态及某些致病克隆的确定;评价不同造血干细胞移植后的免疫重建;探索性区分临床移植物抗白血病效应和移植物抗宿主病;以及为血液肿瘤的免疫靶向治疗提供依据等。

T细胞抗原受体Vβ7阳性T细胞检测在乙型肝炎患者中的临床应用

目的分析在乙型肝炎患者中应用T细胞抗原受体Vβ7阳性(TCR Vβ7+)T细胞检测的应用价值。方法选取我院体检正常的18例健康体检者作为正常组,选取同期体检为急性乙型肝炎患者15例为急性乙型肝炎组,同期体检为慢性乙型肝炎患者35例作为慢性乙型肝炎组,应用流式细胞仪对CD_4^+TCR Vβ7+T细胞、CD_8^+TCR Vβ7+T细胞含量进行检测。结果正常组、急性乙型肝炎组CD_4^+TCR Vβ7+T细胞含量结果与慢性乙型肝炎组之间比较,有统计学差异(P<0.05),正常组、急性乙型肝炎组与慢性乙型肝组CD_8^+TCR Vβ7+T细胞含量比较,有统计学意义(P<0.05)。结论 TCR Vβ7阳性T细胞增殖活性减低可以使乙型肝炎患者感染慢性化。

T-ALL及T细胞株相关TCR Vβ基因谱系和克隆性分析

目的 了解T细胞 急性淋巴细胞白血病 (T ALL)患者外周血中的T细胞及T细胞株的TCRVβ基因谱系及其克隆性增殖情况。方法 利用RT PCR方法扩增 6个不同的T细胞株和 6例初发未治T ALL病人外周血单个核细胞中 2 4个TCRVβ基因的互补决定区 3(CDR3) ,PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度而确定T细胞的克隆性 ,部分T细胞株的单克隆PCR产物进一步进行序列分析。结果 与正常人外周血表达全部 2 4个Vβ亚家族不同 ,6例T ALL病人分别表达 5～ 12个Vβ亚家族。 6例病人均存在 1个或多个Vβ亚家族的寡克隆或双克隆增殖T细胞 ,另外 ,还有一些Vβ亚家族多克隆模式发生改变 ,呈现寡克隆性增殖的趋势。T细胞株多显示为表达一个Vβ亚家族的单克隆T细胞 ,不同T细胞株的CDR3长度和序列不尽相同。结论 T ALL患者外周血T细胞的TCRVβ谱系出现限制性改变 ,均可检测到克隆性增殖T细胞 ,尚需进一步鉴定其性质 (肿瘤性或抗原特异性增殖 ) 。

急性早幼粒细胞白血病患者中TCR Vβ T细胞体内外克隆性增殖的比较

急性早幼粒细胞白血病 ;T细胞受体Vβ基因 ;T细胞培养 ;克隆性增殖为了解急性早幼粒细胞白血病 (APL)患者T细胞在体内或体外经诱导后TCRVβ亚家族的分布和克隆性增殖特点 ,利用T淋巴细胞液体培养法 ,在rhIL 2和抗CD3单抗条件下诱导扩增APL患者单个核细胞 ,并应用RT PCR分别扩增培养前后患者T细胞的TCRVβ 2 4个亚家族基因的互补决定区 3 (CDR3 )片段 ,了解各Vβ亚家族的表达情况 ;对阳性的PCR产物进一步经荧光素标记和基因扫描分析产物的CDR3长度 ,了解T细胞克隆性。结果发现 ,APL患者T细胞仅表达部分Vβ亚家族 ,但经体外培养后可检测到部分新增TCRVβ亚家族T细胞。全部患者存在某些TCRVβ亚家族的克隆性增殖T细胞。 2例患者均出现相似的Vβ1,Vβ3 ,Vβ7,Vβ16和Vβ2 0T细胞的克隆性增殖情况。结论 :T细胞的体外培养可诱导某些Vβ亚家族的表达。在T细胞培养不同时间中 。

NOD/SCID小鼠人源化TCR Vβ亚家族T细胞分布与克隆性分析

目的应用脐血CD34+细胞移植NOD/SCID鼠所建立的人源化SCID模型,分析人源化TCR Vβ亚家族T淋巴细胞分布与克隆性。方法磁珠分选法分离脐血中CD34+细胞,分别经尾静脉输入亚致死剂量照射的NOD/SCID小鼠。第6周处死小鼠提取外周血、骨髓、胸腺的RNA,RT-PCR扩增人TCR Vβ亚家族基因,并用基因扫描进行T细胞克隆性分析。结果采用RT-PCR技术在模型小鼠骨髓中检测到部分人TCR Vβ亚家族基因Vβ1、2、91、3、19。经进一步基因扫描分析,发现部分TCR Vβ亚家族基因Vβ9、13、19呈寡克隆表达。结论在NOD/SCID模型可重建分化成熟的TCR Vβ亚家族T细胞。未能检测到全部人TCR VβT细胞的原因可能与免疫重建不完全或存在移植物抗宿主的反应有关。人源T淋巴细胞在模型鼠骨髓中分化成熟。

CML细胞诱导自体和脐血T细胞TCR Vβ谱系和杀伤性分析

目的 了解慢性粒细胞白血病 (CML)细胞诱导T细胞的TCRVβ亚家族限制性利用和克隆性增殖情况 ,及其对CML细胞的杀伤活性。方法 采用混合淋巴细胞 肿瘤细胞培养 (MLTC)方法 ,利用CML细胞体外诱导脐血或患者的T细胞增殖 ,用RT PCR和基因扫描分析MLTC前后T细胞的 2 4个TCRVβ亚家族基因的互补决定区 (CDR3) ,了解各Vβ亚家族的利用和T细胞克隆性特点。并利用LDH方法检测MLTC后T细胞的细胞毒性。结果 脐血T细胞表达 8～ 11个TCRVβ亚家族 ,经MLTC后 ,2～ 3个Vβ亚家族呈克隆性增殖 ,CML细胞诱导的自体T细胞的TCRVβ亚家族也类似。经MLTC后T细胞对原诱导细胞有较强的杀伤活性。结论 CML细胞可诱导脐血T细胞和自体T细胞TCRVβ优势利用和克隆性增殖 ,诱导后T细胞具有特异性杀伤CML细胞的作用。

甲氰咪呱对K562细胞诱导脐血T细胞TCR Vβ亚家族克隆性的影响

目的研究甲氰咪呱(cimetidine)对K562细胞体外诱导脐血T细胞TCR Vβ亚家族克隆性的影响。方法体外分别将甲氰咪呱、K562细胞、甲氰咪呱+K562细胞与正常人的脐带血单个核细胞(mononuclear cells,MNC)混合培养2周,检测诱导增殖T细胞的特异杀伤活性,同时利用RT-PCR基因扫描技术分析培养后T细胞的TCR Vβ亚家族谱系的选择性利用和克隆性增殖情况。结果经甲氰咪呱、K562细胞、甲氰咪呱+K562细胞诱导培养2周后,各组均不同程度诱导细胞增殖,其中甲氰咪呱联合K562细胞诱导组的T细胞对K562细胞的特异性杀伤作用显著增强(P<0.01)。3组均呈现不同程度的T细胞TCR Vβ亚家族选择性利用,均有TCR Vβ21亚家族呈克隆性增殖。结论甲氰咪呱可协助增强bcr-abl抗原刺激的特异性抗CML T细胞作用。

脐血中TCR Vβ亚家族T细胞的增殖特点

目的 了解脐血T细胞体外诱导后TCRVβ亚家族的分布和克隆性增殖特点 .方法 利用T淋巴细胞液体培养法 ,在不同刺激源 (rhIL - 2、抗CD3 单抗、PHA、AML -M5细胞和bcr -abl多肽 )条件下诱导脐血T细胞扩增 ,并利用RT -PCR分别扩增培养前后脐血T细胞的TCRVβ 2 4个亚家族基因的CDR3片段 ,了解各Vβ亚家族的表达情况 .阳性的PCR产物进一步经荧光素标记和基因扫描分析产物的CDR3长度 ,了解T细胞克隆性 .结果 脐血T细胞仅表达部分Vβ亚家族 ,但经体外培养后 ,可检测到绝大多数TCRVβ亚家族T细胞 ,而经AML -M5细胞和bcr-abl多肽诱导后 ,TCRVβ亚家族T细胞呈限制性表达和Vβ亚家族克隆性增殖 .结论 脐血T细胞具备产生各TCRVβ亚家族T细胞的潜能 ,在白血病相关抗原诱导下 ,具有限制性和克隆性增殖的能力 .

慢性苯中毒病人相关TCR Vα12和Vα19 T细胞克隆性研究

目的:了解慢性苯中毒病人外周血中TCR Vα克隆性增殖T细胞特点。方法:利用RT-PCR方法扩增3例慢性苯中毒病人外周血单个核细胞中29个TCR Vα基因的互补决定区3(CDR3),PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度而确定T细胞的克隆性。克隆性增殖T细胞PCR产物进行CDR3区序列分析。结果:3例慢性苯中毒病人外周血中Vα12和Vα19亚家族T细胞呈克隆性增殖,序列分析显示3例慢性苯中毒病人Vα12(1例)和Vα19(2例)CDR3区氨基酸序列分别是FCALSDRNTGGF,YICAVSHSGGGA和VYICAVNYGGS已被GenBank收录(EU285264、EU379941和EU429520)。结论:在慢性苯中毒病人中发现3个新的TCR Vα亚家族重排序列,外周血T细胞出现的TCR Vα12和Vα19克隆性增殖T细胞可能是机体接触苯后所发生的特异性免疫反应。

淋巴瘤白血病患者TCR Vβ亚家族T细胞的分布及其克隆性

目的 :了解B细胞淋巴瘤白血病 (LL)患者TCRVβ亚家族T细胞的分布及其克隆性。方法 :利用RT -PCR分别扩增 3例LL患者外周血单个核细胞的TCRVβ 2 4个亚家族基因的CDR3,以了解患者各Vβ亚家族的利用情况 ,然后将阳性的PCR产物进一步经荧光素标记和基因扫描分析产物的CDR3长度 ,了解T细胞克隆性。结果 :患者中仅存在 2～ 6个Vβ亚家族T细胞。基因扫描分析显示 ,2例患者外周血中的Vβ1、Vβ3或Vβ4亚家族出现克隆性增殖T细胞。结论 :LL患者外周血存在倾斜性分布和克隆性增殖的Vβ亚家族T细胞 ,这可能是机体T细胞受白血病细胞相关抗原的刺激作用而引起机体产生相应的特异性抗白血病的免疫反应。

弥漫大B型非霍奇金淋巴瘤患者外周血TCR Vβ亚家族T细胞分布和克隆性增生特点

目的:了解弥漫大B淋巴瘤(DLBL)患者外周血T细胞的TCRVβ基因谱系及克隆性增殖情况。方法:利用RT-PCR方法扩增6例DLBL患者外周血单个核细胞中24个TCRVβ基因的互补决定区3(CDR3),PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度而确定T细胞的克隆性。结果:6例DLBL患者分别表达9～20个TCRVβ亚家族。患者均存在1个或多个Vβ亚家族的克隆增殖T细胞,增殖形式包括寡克隆、寡克隆增殖趋势及双克隆。Vβ13和Vβ15亚家族出现克隆增殖性T细胞的频率较高(66.7%)。结论:DLBL患者外周血TCRVβ亚家族T细胞的分布具有特点,表现为TCRVβ亚家族T细胞呈限制性选用和克隆性增殖,这可能是淋巴瘤患者机体对淋巴瘤相关抗原产生的特异性免疫反应。

异基因造血干细胞移植患者外周血TCR Vβ亚家族克隆性增殖动态变化及其与GVHD的关系

本研究观察异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)患者外周血T细胞受体(TCR)Vβ亚家族克隆性增殖的动态变化,分析T细胞的克隆性演变与GVHD的关系。利用RT-PCR方法扩增70例次allo-HSCT后患者(其中17例次出现GVHD)外周血单个核细胞中24个TCRVβ基因的互补决定区3(CDR3),PCR产物经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度,确定T细胞的克隆性。结果表明:移植患者T细胞增殖一般都经历由单克隆向多克隆演变的过程,在移植后60-90天时,逐渐由单克隆转为单克隆和多克隆表达大致各占一半。120天以后,无GVHD患者大多转为多克隆性表达;而GVHD患者受免疫抑制剂和GVHD的影响,直到1年以上仍有部分呈单克隆表达趋势。GVHD患者发生GVHD或靶器官受累最明显的时候,外周血TCRVβ亚家族的表达主要呈现单/双克隆的表现,而经过免疫抑制治疗病情好转后,部分患者出现由寡克隆表达转为多克隆增殖趋势。结论:移植后早期患者尤其是合并GVHD的患者,T细胞呈克隆性增殖和T细胞受体的倾向性利用;随着造血和免疫的恢复,TCRVβ亚家族表达重新恢复趋向正常的多克隆性演变。

应用RT-PCR分析真性红细胞增多症病人TCR Vβ亚家族T细胞的表达

近几年,国外相继报道对T细胞受体(TCR)Vβ24个亚家族基因的分析,从而了解肿瘤或自身免疫性疾病病人的细胞免疫功能状态,并为临床上进一步开展特异性免疫治疗提供新的实验依据。本文利用RT-PCR方法分析3例真性红细胞增多症病人Vβ亚家族T细胞的表达情况。

AML-M2a型细胞诱导自体及异体优势增殖TCR Vβ亚家族T细胞的研究

目的 :研究急性髓细胞性白血病 M2 a亚型 (AML M2 a)患者外周血白血病细胞反应性 T细胞受体V区 β链 (TCR Vβ)亚家族 T细胞体内外优势表达情况及其体外细胞毒性分析。方法 :采用混合淋巴细胞 /肿瘤细胞培养法 (ML TC)将 AML M2 a细胞与自体或正常人外周血 T细胞体外混合培养和扩增 ,用反转录多聚酶链反应 (RT PCR)分析 ML TC前后患者和正常人 T细胞 TCR2 4个 Vβ亚家族的表达情况 ,同时用四甲基偶氮唑盐 (MTT)法对其进行细胞毒性分析。结果 :AML M2 a患者和正常人 T细胞在 ML TC培养后均出现了 TCR Vβ亚家族优势表达情况 ,与淋巴因子激活杀伤细胞 (L AK细胞 )相比具较高特异性的细胞毒性 (P<0 .0 1)。结论 :AML M2 a细胞可以诱导自体与异体特异性细胞毒性 T细胞 (CTL ) ,且其主要为一些优势的TCR Vβ亚家族

TCRVβ7.1转基因治疗与多西他赛联用对MCF-7细胞的体外杀伤作用

目的观察TCRVβ7.1基因修饰的T淋巴细胞与化疗药多西他赛联用对乳腺癌细胞株MCF-7的体外杀伤作用。方法脂质体介导进行基因转染,流式细胞术检测TCRVβ7.1基因表达及基因修饰的T淋巴细胞作用后乳腺癌细胞MCF-7的调亡率,MTT法检测TCRVβ7.1基因修饰的T淋巴细胞与多西他赛对MCF-7的杀伤活性,Burgi修正公式评价药物联合应用的细胞杀伤效果是否有协同作用。结果TCRVβ7.1基因修饰的T淋巴细胞与化疗药多西他赛联用对乳腺癌细胞MCF-7细胞杀伤效果有明显的协同作用,且协同强度随多西他赛l浓度的降低而增强,序贯给药分析显示两种给药顺序对协同作用没有显著影响。结论TCRVβ7.1基因修饰的T淋巴细胞与化疗药多西他赛联用对乳腺癌细胞MCF-7有明显的协同作用。