细粒棘球绦虫抗原Fis1T细胞表位肽缓解过敏性哮喘小鼠气道炎症的免疫学作用研究

目的探讨细粒棘球绦虫Fis1蛋白的T细胞表位肽(Eg.Fis183-102)对过敏性哮喘小鼠气道炎症的缓解作用及免疫学作用机制。方法1)体内试验:将24只6~8周雌性BALB/C小鼠随机分为3组(每组8只),其中B组为对照组,C组为过敏性哮喘组(OVA),T组为干预组(OVA+Eg.Fis183-102)。采用ELISA法检测小鼠血清OVA特异性IgE水平;采用HE,PAS,MASSON组织染色检查小鼠肺组织病理变化;采用流式细胞术分析肺脏和脾脏组织中嗜酸性粒细胞比例、Th1和Th2的分群及比例。2)体外试验:采用裂红法分离小鼠脾脏单个核细胞,每孔以1×106个细胞铺板,分为3组(每组3个复孔),其中B组为对照组,C组为刀豆蛋白刺激组(ConA),T组为干预组(ConA+Eg.Fis183-102),培养3 d后收集上清,采用ELISA法检测IFN-γ和IL-4水平。结果1)体内试验:与C组相比,T组小鼠肺组织的炎细胞浸润、胶原沉积等病理损伤有所改善,血清OVA特异性IgE水平、肺组织嗜酸性粒细胞比例、肺脏和脾脏Th2细胞比例均显著下降(均P<0.05),肺和脾Th1细胞比例显著上升(均P<0.05)。2)体外试验:与B组相比,C组小鼠脾脏单个核细胞培养上清中IFN-γ和IL-4水平均显著上升(均P<0.05);与C组相比,T组脾脏单个核细胞培养上清中IFN-γ水平显著上升,IL-4水平显著下降(均P<0.01),与体内试验结果一致。结论Eg.Fis183-102可缓解过敏性哮喘小鼠肺组织炎症损伤,降低IgE的分泌,并可能通过纠正Th1/Th2免疫应答失衡抑制OVA诱导的过敏性哮喘小鼠的气道炎症。

HLA- A0201、A1101和A2402限制性HBV抗原肽的虚拟预测与实验鉴定

目的:筛选和鉴定基因总频率>50%的3种人类白细胞抗原(HLA)(A0201、A1101和A2402)分子限制的乙型肝炎病毒(HBV)抗原T细胞表位肽。方法:利用6种在线T细胞表位肽预测数据库,针对乙肝病毒表面抗原、核心抗原、DNA多聚酶和X蛋白等4种抗原,虚拟筛选3种HLA-A分子限制的T细胞表位肽。从南京市第二医院检验科收集乙型肝炎住院患者的外周抗凝血,制备外周血单个核细胞,通过γ干扰素酶联免疫斑点法(IFN-γELISPOT)筛选出对任何一组混合多肽呈现特异T细胞反应的乙型肝炎患者;重新采集这些乙型肝炎患者的新鲜外周血,用IFN-γELISPOT法鉴定混合肽中单种抗原肽的免疫原性;并采用聚合酶链反应测序分型法对这些乙型肝炎患者进行HLA-A等位基因分型。结果:经鉴定具有免疫原性的HLA-A0201分子限制性HBV表位肽8种,A1101限制性HBV表位肽6种,A2402限制性HBV表位肽7种。结论:本研究筛选鉴定了3种HLA-A分子限制的4种HBV抗原的21种T细胞表位肽,其中11种未见报道,而且HLA-A1101分子限制性表位肽的免疫原性明显弱于HLA-A0201和A2402分子限制性表位肽。

LRRC15来源HLA-A2.1限制性CTL表位肽鉴定及其抗乳腺癌效应评价

目的鉴定富含亮氨酸重复蛋白15(leucine-rich repeat-containing protein-15,LRRC15)来源的优势细胞毒性T淋巴细胞(cytosolic T lymphocyte,CTL)表位肽,并验证其诱导CTL特异性抗乳腺癌免疫效应。方法收集中国医科大学附属第一医院乳腺癌外科自2010年1月至2010年7月经手术病理证实的乳腺癌组织及正常组织各30例。利用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库和免疫组化方法评估LRRC15在乳腺癌中表达情况。利用免疫表位数据库(Immune Epitope Database and Analysis Resource,IEDB)联合SYFPEITHI数据库预测LRRC15蛋白序列中HLA-A2.1限定性CTL表位肽。利用分子对接软件MOE、T2亲和力实验和荧光共聚焦技术确认候选CTL表位肽与HLA-A2.1分子亲和性。利用酶联免疫斑点实验(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)以及流式细胞术检测CTL表位肽免疫活性。利用钙黄素和Dil标记乳腺癌细胞评价CTL表位肽诱导的杀伤效应。建立乳腺癌移植瘤模型进行免疫回输,在体内评估CTL表位肽诱导的抗肿瘤效应。结果相比于正常组织,LRRC15 mRNA在乳腺癌组织中表达水平明显增高,组间差异有统计学意义[(4.00±1.57)比(1.31±0.72),Z=14.85,P<0.05];LRRC15 mRNA表达与CD8+T细胞浸润呈显著正相关性(r=0.20,P<0.001)。LRRC15蛋白在乳腺癌组织中呈现高表达,可作为乳腺癌潜在靶点。在筛选得到的3条候选CTL表位肽中,L2与HLA-A2.1分子具有最高亲和力(FI=2.490)。与阴性肽组相比,L2能够明显提升CD8+T细胞亚群比例(27.70%比45.50%),L2负载的树突状细胞(dendritic cells,DCs)能够明显提升CD8+T细胞分泌干扰素(interferon,IFN)-γ的水平(50.20%比74.90%)。在最高效靶比时,L2诱导的效应细胞对乳腺癌细胞系MDA-MB-231的杀伤效应明显高于阴性肽对照组,组间差异有统计学意义[(19.30±2.20)%比(8.60±1.40)%,t=1.45,P<0.05],但对乳腺上皮细胞MCF-10A无杀伤效应(P>0.05)。L2负载DCs诱导的CTL细胞对2例乳腺癌组织来源的原代肿瘤细胞表现出明显的杀伤效应,且杀伤效应随着效靶比增高而增加。与阴性肽相比,L2诱导的CTL效应细胞使小鼠移植瘤体积明显降低[(450±110)mm3比(725±130)mm3,t=0.36,P<0.05],生存时间明显延长[(35±4.5)d比(29.16±1.94)d,LogRankP=0.000]。结论LRRC15来源HLA-A2.1限定性CTL表位肽L2能够在体外有效的诱导CTL免疫应答反应,并发挥抗乳腺癌效应。