TAIL-PCR法快速分离红曲霉色素突变株T-DNA插入位点侧翼序列

采用热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)法分离红曲霉色素突变株T-DNA插入位点的侧翼序列,扩增到了长度介于500bp～1300bp之间的7个DNA片段,对这些DNA片段测序,并采用生物信息学方法对测序结果进行了分析,表明其中有1个片段与烟曲霉Af293发育调控子flbA的相似性较高。TAIL-PCR法成功应用于分离红曲霉突变株T-DNA插入位点的侧翼序列,为大规模获取插入位点侧翼序列建立了可行的方法,也为进一步研究红曲霉功能基因奠定了基础。

高效、新T-DNA侧翼序列分离技术--Actail-PCR

【目的】建立一种有效分离T-DNA插入突变体侧翼基因组序列的方法。【方法】分离侧翼的目标基因组序列是利用T-DNA标签法研究植物功能基因组学的一个关键步骤,笔者发展稳定高效的Actail-PCR分离技术。该技术一侧引物来自于T-DNA载体,另一侧引物为一个复性控制引物。复性控制引物在3'端为一个14bp的随机简并引物,在5'端非目标尾部序列接上一个通用引物,中间由5个多聚脱氧次黄嘌呤核苷(poly(dI))连接。【结果】Actail-PCR技术将随机简并引物重新编辑成复性控制引物,在40℃的低严谨条件下,3'端的随机简并引物可以与T-DNA插入突变体的侧翼目标区段随机的结合,扩增得到目标片段,随后利用5'端的通用引物与T-DNA载体上的巢式引物依次组合,在65℃(10个循环后逐步降温至58℃)的高严谨条件下逐步扩增特异片段,同时抑制非特异性扩增,可以显著提高目标片段的扩增效率,减少假阳性。【结论】相对传统的TAIL-PCR,Actail-PCR技术可以更高效地分离T-DNA插入突变体的侧翼基因组序列。

应用Tail-PCR扩增蓝猪耳T-DNA侧翼序列

蓝猪耳是一种重要的具有观赏和科研价值的花卉植物.采用TAIL-PCR成功扩增了转基因蓝猪耳T-DNA插入位点的侧翼序列,扩增片断长度为200～2000bp,大多数片段在400bp和800bp左右,其中36%的序列含有植物的同源序列.通过与GenBank数据库比对,确定了部分T-DNA插入位点周边序列编码的可能蛋白,并提交序列7条;另外还对T-DNA转化植物时整合的位点进行了分析,发现断裂位点集中在距右边界15～18bp和右边界外234bp处,分别占总扩增片段的47.62%和38.10%.这为利用T-DNA标签进行蓝猪耳基因克隆和功能分析提供了实验技术上的保证.

扩展目标跟踪Student’s t逆Wishart平滑算法

脉冲干扰和离群量测信息等因素通常会导致异常的厚尾噪声,这使得以高斯假设为前提的扩展目标跟踪(ETT)估计器的性能急剧降低,针对该问题该文提出一种基于扩展目标随机矩阵模型(RMM)的Student’s t逆Wishart平滑(StIWS)算法。首先,将目标的运动状态以及过程噪声和量测噪声建模为Student’s t分布以表征异常噪声对扩展目标概率分布的影响,将目标扩展状态建模为服从逆Wishart分布的随机矩阵。然后,在Student’s t贝叶斯平滑框架下,详细推导了能在扩展目标的多重特征动态演变的过程中有效估计目标状态的StIWS算法。最后,通过扩展目标跟踪的仿真实验结果和真实场景实验结果验证了所提算法的有效性。

稻瘟菌突变体T-DNA插入位点的精细定位和插入模式的研究

随机挑取已构建的37个稻瘟菌T-DNA突变株,利用TAIL-PCR技术扩增出T-DNA插入位点的侧翼序列,测序并进行比对分析。结果显示:成功获得扩增产物并测序的序列共有39条,T-DNA边界序列为稻瘟菌序列的有19条,其余20条为载体主干序列。在这有效扩增为稻瘟菌序列的19条中,有10条是T-DNA右侧翼序列与稻瘟菌序列,9条为左侧翼序列加稻瘟菌序列。分析T-DNA剪切位点,10条右侧翼序列中有9条的剪切位点相同,这与农杆菌介导T-DNA转化植物一样。而左边界的剪切位点就没有这种规律性。研究也精细确定了17个不同突变株的T-DNA插入位置,为后续的基因功能研究奠定基础。

厚尾噪声条件下的学生t泊松多伯努利混合滤波器

针对运动过程和观测过程均受到异常噪声干扰的复杂不确定性多目标跟踪问题,本文创新性地提出了学生t混合泊松多伯努利混合滤波器.首先,直接将广域分布的异常噪声特性建模为学生t分布.随后,将泊松多伯努利混合滤波器的泊松点过程(PPP)和多伯努利混合(MBM)的概率密度参数合理的近似为学生t混合形式.其次,基于多目标概率密度的学生t混合模型,详细推导了泊松多伯努利混合滤波器学生t混合共轭先验形式,建立了学生t混合泊松多伯努利混合的闭式递推框架.最后,通过带显著拖尾分布特性的过程噪声和量测噪声共同干扰的复杂多目标跟踪仿真实验,验证了所提滤波算法的有效性.

哈茨木霉厚垣孢子产生突变体的筛选及T-DNA标签序列的克隆

利用PD液体培养基从哈茨木霉T-DNA插入突变体库中筛选出在产孢性状上与野生型菌株明显不同突变子7株,其突变表型主要表现在分生孢子产生数量显著减少和菌丝上有大量厚垣孢子分化。利用TAIL-PCR方法对7株突变体的侧翼序列进行克隆,从5个突变体中获取了5条T-DNA侧翼序列。为木霉菌厚垣孢子产生相关全长基因的克隆和产孢机制的研究奠定了基础。

哈茨木霉突变体T-DNA插入位点侧翼序列的克隆及其插入序列分析

利用分子生物学技术扩增T-DNA插入突变体中T-DNA侧翼未知序列是克隆突变相关基因、研究T-DNA整合方式的基础,TAIL-PCR是扩增已知序列侧翼未知序列的有效方法,本研究根据哈茨木霉的基因组特点,引用和设计了12条随机AD引物,用这些引物分别与3条右边界嵌套特异引物进行组合对哈茨木霉突变子的T-DNA侧翼未知序列进行扩增,发现不同的随机引物的扩增效率差异很大,以AD5的扩增效率最高,能扩增出80%的T-DNA插入位点的侧翼序列。随机挑取哈茨木霉T-DNA插入突变子52个,选用引物AD5对T-DNA插入位点的侧翼序列进行TAIL-PCR扩增并分析扩增序列发现,在获得的42条侧翼序列中7条只含有质粒序列、33条对应着单一的侧翼序列T-DNA、另外2条序列相同。34条T-DNA侧翼边界序列中13条保存着完整的右边界序列,21条T-DNA边界序列存在一定程度的缺失现象,说明农杆菌转化哈茨木霉的过程中T-DNA右边界存在一定程度的剪切。该研究的进行对明确农杆菌介导的木霉遗传转化过程中T-DNA的整合方式具有一定意义,为研究农杆菌转化木霉的机理奠定了实验基础。研究也精细确定了33个不同突变株的T-DNA插入位置,为后续的基因功能研究奠定基础。

高平尾布局民用飞机平尾非对称载荷研究

民用飞机高平尾布局可减小平尾处的下洗与速度阻滞,具有更高的平尾效率,同时高平尾的非对称载荷会构成垂尾载荷的严重情况。提出高平尾飞机侧滑工况下平尾升力的理论计算公式,得到了平尾升力随侧滑角变化的计算方程。然后,采用CFD方法对非对称侧滑来流下的高平尾载荷进行了仿真分析,验证了所提出计算公式的正确性。进一步结合理论计算方程和全机CFD流场仿真结果,确定了不同变量对高平尾非对称载荷的影响程度,可为高平尾飞机的非对称载荷设计提供设计依据。

基于多元t-分布的外汇期权市场风险非线性VaR度量模型

主要研究当汇率回报呈多元t-分布时,对于外汇期权非线性头寸的VaR(Value at Risk)度量的问题。在推导出多个外汇期权的投资组合的二次近拟的矩母函数表达式基础上,本文使用傅里叶变换、切比雪夫不等式、数值转换计算求出投资组合的VaR的值,并和基于多元正态分布Cornish-Fisher模型以及基于Delta-正态模型计算所得的VaR值了进行比较。这种方法克服了厚尾分布的VaR计算的困难。

水稻T-DNA插入群体的建立及侧临序列的获得与分析

采用农杆菌介导转化方法,将携带有GUS基因1301质粒转入日本晴水稻品种中,建立水稻T-DNA插入群体5 200个。研究表明:通过PCR和Southern Blot分析证明了再生植株为转基因植株;通过改进热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法,已成功地分离并测定了437个株系的侧翼序列;通过序列同源性分析表明,有147个序列只包含有载体序列,有214个序列中包含有与T-DNA右边界相邻的水稻基因组序列;通过水稻边界序列与网上水稻数据库中基因组序列比对,将3个突变体的T-DNA插入位点定位于水稻特定染色体上。

T-SPH排队队长平稳分布的尾部分析

在复杂随机模型的研究中,经常会出现水平和位相都是无限的拟生灭过程,对这类过程,平稳分布的计算仍然是一个未很好解决的难题.然而对一类比较特殊三对角无限位相拟生灭过程,简记为T-QBD过程,文献[1]指出,在一定条件下可以估计其平稳分布的尾部特征.本文对文献[1]中提出的方法在某一环节上作了改进,使之更适合于实际计算,并用此方法分析了两个具有实际应用背景的排队模型,即T-SPH/M/1排队和M/T-SPH/1排队,分析结果表明,在一定条件下,这两类排队系统的队长分布的尾部都具有几何衰减的特性.

量测随机丢失下基于容积卡尔曼滤波的厚尾噪声处理方法

针对量测随机丢失和厚尾量测噪声条件下的非线性状态估计易发散问题,提出了一种新的非线性卡尔曼滤波方法。引入服从Gamma分布的辅助参数,将厚尾量测噪声建模为Student’s t分布,以解决厚尾噪声导致的状态估计易发散问题,并采用服从Benroulli分布的随机变量来描述量测信号随机丢失的现象;在量测随机丢失下,基于目标状态和未知参数建立联合后验分布,并使用变分贝叶斯方法,联合估计系统状态、量测丢失概率和未知的厚尾噪声。非线性目标跟踪仿真实验表明,提出的算法可自适应估计未知的量测丢失概率,在野值概率为5%的条件下,算法目标跟踪的位置、速度和转动速率均方根误差分别为对比算法的37%、28%和60%;在野值概率为10%的条件下,其他算法均出现了发散现象,而提出的算法依然能够以较低的误差跟踪目标,体现了所提算法良好的鲁棒性和优越性。

利用GFP基因的黄瓜T-DNA插入突变体构建与快速鉴定

为促进黄瓜功能基因组学研究,本研究开展了黄瓜T-DNA插入突变体快速构建与鉴定方法的研究。基于对黄瓜遗传转化体系农杆菌侵染活力和共培养条件的优化,本研究以绿色荧光蛋白GFP基因为插入片段,进行黄瓜T-DNA插入突变体的创制,并利用荧光显微镜进行快速鉴定,最后采用TAIL-PCR技术对突变体进行分子鉴定,确定突变位点。结果表明,选取农杆菌侵染液在活化至12~18 h时具有最佳的活力和浓度,而最佳共培养温度为23℃。采用体式荧光显微镜快速鉴定,从2 978个转化外植体中鉴定得到3株表达GFP再生苗,转化率为1.00‰。TAIL-PCR成功鉴定了一个突变体,其插入位点位于CsaV31G032940基因的第10个外显子中,该基因在拟南芥中的同源基因为AT4G18950 (blue light-dependent H+-ATPase phosphorylation 1,BHP1),参与蓝光介导的气孔开放过程,但在正常栽培环境中该突变体的T0植株与野生型无差异。本研究结果对黄瓜功能基因组学研究具有重要意义。

水稻剑叶突变体的表型及T-DNA旁邻基因分析

从已构建的水稻(Oryza sativa L.)T-DNA插入突变体中鉴定获得一株穗部额外发育出叶片的突变体,并根据该叶片的形态学位置将其命名为剑叶突变体(J4)。研究表明这种额外发育的叶片呈现明显的缺陷,主要表现为叶片短小、表皮细胞变小、叶片中维管束数目减少等。进一步通过TAIL-PCR和inverse-PCR的方法克隆该突变体中T-DNA插入位置的旁邻序列,从而准确地将T-DNA定位到2号染色体上。基因表达分析显示,T-DNA插入位置附近的AK100376基因在J4突变体以及表型类似突变体neck leaf 1中的表达均被明显下调,可初步将其确定为与剑叶突变体表型相关的候选基因。

苹果树腐烂病菌T-DNA插入突变体表型及致病突变体研究

【目的】筛选苹果树腐烂病菌T-DNA插入表型或致病突变体,为研究该病菌的表型及致病相关基因提供起始材料。【方法】从建立的T-DNA插入突变体库中,随机挑选230株突变体菌株进行表型观察及致病性测定,并对部分致病突变体进行TAIL-PCR侧翼扩增。【结果】大部分的突变体与野生型菌株03-8在表型及致病性方面无明显差异,仅30.87%的突变体表现出了明显的变化;其中16株突变体(占突变体总数的6.95%)致病性发生了明显的增强,而表型与03-8相比无明显的变化;20株突变体(占突变体总数的8.69%)致病性与03-8无显著性差异,但是表型发生了明显的变化;16.1%的突变体则同时表现出表型及致病性的显著差异,其中28株表现为致病性显著降低,7株致病性丧失。通过对15株致病突变体侧翼序列的扩增,获得了7条T-DNA侧翼序列,其中突变体X912的侧翼序列被注释为黄曲霉(Aspergillus flavus)阿魏酸酯酶B前体。【结论】获得了多个不同的苹果树腐烂病菌表型或致病突变体,为研究该病菌的生长发育及致病相关基因奠定了良好的基础。

基于Student-t分布的混合模型图像分割方法

传统图像分割方法在分割被重尾噪声污染的图像时的分割效果不理想。针对该问题,提出一种基于Student-t分布的图像分割方法。该方法根据像素间的空间关系,计算出其先验概率,使用梯度下降法优化参数,从而最小化误差函数,在参数优化后得到像素点的后验概率值,对像素进行标记以实现图像分割。实验结果表明,在处理被重尾噪声腐蚀的图像时,与传统的K-均值、模糊C-均值等图像分割方法相比,该方法的误分率较低,分割效果较好。

非对称三参数Student-t分布的参数估计及应用

文章基于t分布构造了一个新的非对称三参数Student-t分布。推导了新分布的累计分布函数、分位数函数、随机变量表达式和原点矩估计等基础性质,使用了矩方法、极大似然估计法和贝叶斯估计法等进行了参数估计,并通过生成模拟数据的方法比较验证了三种方法的合理性。最后,将新分布代入实例中拟合,结果表明新分布相比其他的分布,在非对称和厚尾方面具有更好的拟合能力。

围产期小尾寒羊血清T-SOD活性和MDA含量变化的研究

[目的]研究围产期小尾寒羊血清T-SOD活性和MDA含量的变化。[方法]选择20只年龄在2~5岁之间的小尾寒羊,其中10只为待产母羊,10只为空怀母羊,分别于产前20d、产前10d、产前1d、产后1d、产后10d、产后20d颈静脉采血,测定血清T-SOD活性和MDA含量。[结果]围产期小尾寒羊在整个围产期内血清中T-SOD活性呈先下降后逐渐升高的动态变化,其中,在产前1d出现最低值且围产期小尾寒羊T-SOD活性均低于空怀小尾寒羊;围产期小尾寒羊在整个围产期内血清中MDA含量呈先上升后逐渐下降的动态变化,其中,在产后1d出现最低值且围产期小尾寒羊MDA含量均高于空怀小尾寒羊。[结论]怀孕和分娩对小尾寒羊T-SOD活性和MDA含量有一定的影响。

尖孢镰刀菌T-DNA插入突变体的筛选及插入基因分析

在建立T-DNA插入突变体库的基础上,为筛选出致病力明显下降的突变体并明确其插入位点信息,对突变体的培养表型和致病性差异进行测试,研究结果为进一步阐明尖孢镰刀菌致病分子机制奠定基础。在前期构建的T-DNA插入突变体库中,采用PCR检测筛选了300株T-DNA插入突变体,观察和测定菌落形态、生长速率、产孢量、遗传稳定性等生物学性状,用海棠胚根接种法比较突变体致病力差异,对筛选到的致病力明显减弱的突变体进行插入位点侧翼序列分析及Southern杂交分析。结果显示,283个供试突变体都已插入目的基因,并伴有绿色荧光。将T-DNA插入突变体连续转接培养5代后,在含潮霉素B的培养基上能稳定遗传,且菌落形态和颜色无明显改变;在对283株突变体进行致病性测定中,87.9%的突变菌株致病力减弱,在致病力减弱的突变体中,HS2-520、HS2-1016和HS2-2109几乎丧失了致病性。选取8株致病力明显减弱的突变体进行Southern杂交分析,结果显示,其中6株突变体为单拷贝插入菌株,1株为双拷贝插入菌株。对这8株突变体进行了TAIL-PCR侧翼序列扩增,经公司测序,与野生菌株HS2基因组序列比对后获得12条侧翼序列,明确了其中3条侧翼序列为尖孢镰刀菌序列。获得致病力明显减弱的单拷贝插入突变体6株,明确了其中2株突变体的插入位点侧翼序列信息。