胃癌干细胞在胃癌侵袭、转移中及血管形成中的作用和机制

背景:肿瘤干细胞及其分化的血管细胞对于化疗、分子靶向治疗并不敏感,虽然能够减少肿瘤总体的血供,却助长了肿瘤的浸入及转移,成为治疗失败的主要机制。目的:分析胃癌干细胞在胃癌侵袭、转移中的机制及其在血管形成中的作用。方法:取20株胃癌肿瘤干细胞CSC-G和普通胃癌细胞SGC7901细胞,普通癌细胞培养条件为10%的PBS;肿瘤干细胞CSC-G培养条件为:DMEM/F12(1∶1)、B27(2%)、表皮生长因子(20μg/L)。对2种细胞进行球形克隆形成试验、平板克隆试验以及Transwell侵袭性实验,观察胃癌肿瘤干细胞的侵袭性;测定CD44、E-cadherin中mR NA水平及蛋白表达水平,观察细胞的转移能力;利用细胞划痕试验、Transwell迁移实验和成环实验观察细胞的血管形成能力。结果与结论:(1)普通癌细胞均贴壁生长,肿瘤干细胞CSC-G为悬浮生长,生长后显微镜下显示为梭形间质形态;(2)球形克隆形成试验结果:普通癌细胞瘤球数量显著少于肿瘤干细胞CSC-G(P<0.05);(3)平克隆试验结果:胃癌肿瘤干细胞瘤球数量显著多余普通胃癌细胞(P<0.05);(4)转移性试验结果:胃癌肿瘤干细胞穿过基底膜细胞数显著多于普通胃癌(P<0.05);(5)划痕试验结果:肿瘤干细胞CSC-G迁移距离、成环试验中成环数量显著多于普通胃癌细胞(P<0.05)。(6)结果提示:胃癌肿瘤干细胞侵袭能力高于普通胃癌细胞,且胃癌干细胞迁移能力以及血管成形能力较强,它可以通过形成血管等途径来进一步促进胃癌的发生与发展。

高低不同分化特性人成骨肉瘤MG-63克隆细胞株的建立

目的:建立分化程度高低不同的骨肉瘤细胞株.方法:用有限稀释法将人成骨肉瘤MG-63细胞系单克隆化,并作如下鉴定:(1)细胞增殖;(2)细胞形态学;(3)软琼脂克隆形成率;(4)染色体分析;(5)细胞周期时相分析;(6)碱性磷酸酶的活性;(7)细胞运动能力;(8)裸鼠成瘤实验.结果:共得到23个克隆,命名为MG-63-1～MG-63-23.其中的5、18号细胞株具有明显差异,18号为大核长梭形细胞,无接触抑制,克隆形成率高,体内成瘤时间短,代表低分化的骨肉瘤细胞株.5号以短梭形为主,核质比例变小,有一定的接触抑制,致瘤能力较低,为高分化的骨肉瘤细胞株.结论:通过对骨肉瘤细胞系MG-63的单克隆化,建立了具有高、低不同分化程度的两个人骨肉瘤细胞株.

谷氨酰胺代谢对人甲状腺癌细胞系体外增殖能力影响的实验研究

目的:探讨谷氨酰胺(Gln)代谢对人甲状腺癌细胞系体外增殖能力的影响。方法:体外用含不同浓度Gln培养基培养人甲状腺癌细胞系C643、IHH4、8505C、8305C、K1和TPC-1。通过噻唑蓝(MTT)及平板克隆形成实验评价Gln对甲状腺癌细胞体外增殖及克隆形成能力的影响。采用流式细胞仪检测Gln对甲状腺癌细胞凋亡的影响。利用三磷酸腺苷(ATP)检测试剂盒检测不同浓度Gln培养条件下甲状腺癌细胞ATP生成能力。结果:与含有Gln的培养基相比,不含Gln培养基培养的6株甲状腺癌细胞的增殖活性、克隆形成能力、ATP生成能力明显降低,细胞凋亡明显增加(均P<0.05)。结论:甲状腺癌细胞体外生长依赖Gln,剥夺Gln后甲状腺癌细胞体外增殖能力受到抑制,细胞凋亡增加。Gln代谢可能成为甲状腺癌尤其是未分化甲状腺癌的潜在治疗靶点。

FATE/BJ-HCC-2基因表达促进细胞增殖及肿瘤形成

FATE/BJ-HCC-2是本实验室鉴定的一个新的肿瘤-睾丸抗原基因,定位于Xq28染色体.为探讨FATE/BJ-HCC-2对细胞生物学行为的影响及裸鼠体内肿瘤形成能力的改变,分别采用脂质体转染真核表达载体及逆转录病毒感染两种方式,获得了FATE/BJ-HCC-2表达的Bel-7402单克隆细胞株及NIH-3T3细胞克隆,并通过RT-PCR和Western印迹在基因和蛋白水平鉴定了FATE/BJ-HCC-2表达情况.通过3H-TdR参入法,检测细胞的增殖能力;通过稀释铺板集落形成率测定和软琼脂集落形成实验,检测细胞的集落形成能力;通过裸鼠体内细胞注射成瘤,检测细胞成瘤性和肿瘤生长速度.结果表明,FATE/BJ-HCC-2基因表达能明显提高细胞体外增殖、克隆形成能力和成瘤性.提示其对肿瘤的发生发展起到促进作用.

IGF-FOXO3a通路对肝癌干细胞自我更新能力的调控

目的探讨FOXO3a对肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs)自我更新能力的调控作用以及其相关机制。方法流式细胞仪分选获取肝癌干细胞,实时荧光定量PCR(real time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)检测FOXO3a在肝癌干细胞中的表达情况;利用类胰岛素生长因子(insulin-like growth factor,IGF)的抑制剂或激活剂改变IGF活性,Western blot和qRT-PCR检测FOXO3a表达的改变;包装、纯化表达和干扰FOXO3a的慢病毒并进行细胞的感染,Western blot检测其过表达和干扰效率;采用细胞克隆形成实验和细胞成球生长能力实验检测过表达或干扰FOXO3a后细胞自我更新能力的改变,以及肝癌细胞中激活IGF信号,同时过表达FOXO3a后细胞自我更新能力的改变。结果 FOXO3a在肝癌干细胞中的表达明显低于肝癌细胞(P<0.01),并且受到IGF的负向调控;构建了稳定过表达和干扰FOXO3a的细胞模型,并发现过表达FOXO3a后,细胞的克隆形成能力和成球生长能力均降低,而干扰FOXO3a后,细胞的克隆形成能力和成球生长能力均得到了提升;激活IGF信号,同时过表达FOXO3a后,细胞的克隆形成能力和成球生长能力下降。结论 FOXO3a对肝癌干细胞的自我更新能力具有负向调控作用,且可受到IGF的负调节,并介导IGF对肝癌干细胞的自我更新能力的调控。

年龄对人骨髓间充质干细胞体外增殖能力的影响

背景:人骨髓间充质干细胞的增殖和分化可以修复组织器官损伤,随着年龄增长人体组织修复能力减弱,是否人骨髓间充质干细胞增殖能力随年龄增长而减弱尚不清楚。目的:观察年龄对人骨髓间充质干细胞体外增殖能力的影响。方法:15份骨髓标本来源于青岛市中心医院骨折或行髋关节置换患者,其中儿童、成年人、老年人各5例,年龄分别为7～12岁,20～55岁,60～90岁。抽取人骨髓组织,采用密度梯度离心法分离出单核细胞并接种于培养瓶内,在第5天计数集落形成单位;当贴壁细胞融合后进行传代,第1代细胞分两种方式进行培养:192个细胞接种于2个96孔板观察单细胞克隆形成能力,12500个细胞以5×103/cm2接种于培养瓶内并以此密度连续传代观察细胞增殖率。结果与结论:不同年龄人群骨髓间充质干细胞体外培养集落形成单位和细胞增殖率无明显区别(P>0.05),但单细胞克隆形成能力随年龄增长而下降(P<0.01)。提示骨髓间充质干细胞的数量和增殖能力没有随年龄的增长而下降,但其中能形成单细胞克隆未定向干细胞的数量随年龄的增长而减少。

两种人毛囊外根鞘细胞培养方法的比较

目的 建立外根鞘细胞的培养方法 ,并比较不同方法的优缺点 ,以进一步探索毛囊干细胞的体外培养条件。方法 分别采用组织法和消化法进行外根鞘细胞的培养。结果 两种方法均能培养出大量的外根鞘细胞并进行传代 ,组织法操作简单 ,但细胞生长比率低 ,细胞不易融合 ,消化法培养细胞分布均匀 ,细胞克隆形成能力强 ,增殖迅速。结论 消化法适合于进行毛囊外根鞘细胞的体外培养。

兔髓核细胞体外最佳培养条件的探索

[目的]探索髓核细胞培养的最佳条件,为进一步作为椎间盘组织工程种子细胞提供可能。[方法]以DMEM/F12(1∶1,添加FBS10%,pH7.2)作为基础培养液,通过依次改变培养液pH、胎牛血清浓度、抗坏血酸浓度、培养温度、CO2浓度以及培养板处理,计数10d克隆形成数,检测细胞生长代谢,确定最佳培养条件。[结果](1)髓核细胞不易贴壁生长,在未经处理的培养板中进行单层培养细胞增殖能力较弱,克隆形成少;而铺被多聚赖氨酸的培养板中培养可以较快贴壁并形成相对较多的克隆;(2)生长培养液在DMEM/F12(1∶1),pH7.0、胎牛血清浓度15%、抗坏血酸30μg/ml、温度37℃以及CO2浓度为5%时,髓核细胞生长良好,II型胶原和聚集蛋白聚糖(aggrecan)mRNA表达增高。[结论]在最佳培养条件下,髓核细胞生长状态良好,为椎间盘组织工程髓核细胞的培养奠定了基础。

miR-194对人非小细胞肺癌细胞系A549增殖、凋亡的影响及其机制

目的 观察微小RNA-194(miR-194)对人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系A549增殖、凋亡的影响,并探讨其机制。方法 取A549细胞和人正常肺上皮细胞16HBE,采用qRT-PCR法检测两种细胞miR-194。常规培养A549细胞,经脂质体分别转染miR-194抑制物、miR-194模拟物(mimics)、对照48h(分别计为A、B、C组),采用qRT-PCR验证转染效果,MTS法检测细胞增殖能力,平板克隆实验检测细胞克隆形成能力,流式细胞仪检测细胞凋亡能力,Western blotting法检测细胞JAK2、pSTAT3、活化的Caspase-3蛋白。结果 A549、16HBE细胞中miR-194相对表达量分别为1.00±0.10、8.17±0.14,两者比较,P<0.05。A、B、C组miR-194相对表达量分别为0.31±0.11、8.35±0.31、1.00±0.10,A、B组分别与C组比较,P均<0.05。A组转染24、48、72h的OD值分别为0.494±0.069、0.843±0.084、1.111±0.109,B组分别为0.355±0.026、0.510±0.049、0.706±0.087,C组分别为0.427±0.022、0.664±0.068、0.906±0.060,A、B组分别与C组比较,P均<0.05。A、B、C组细胞克隆数目分别为(232.12±10.82)、(43.67±10.97)、(127.33±6.43)个,A、B组分别与C组比较,P均<0.05。与C组比较,A组细胞凋亡现象及数目明显减少,B组细胞凋亡现象及数目明显增多;A、B、C组细胞凋亡率分别为4.58%±1.01%、21.45%±1.78%、10.23%±1.65%,A、B组分别与C组比较,P均<0.05。A组JAK2、pSTAT3、活化的Caspase-3蛋白相对表达量分别为5.97±0.24、4.52±0.18、0.11±0.04,B组分别为0.34±0.03、0.21±0.02、7.21±0.79,C组分别为1.00±0.10、1.00±0.10、1.00±0.10,A、B组分别与C组比较,P均<0.05。结论 miR-194能抑制A549细胞的增殖、克隆形成能力,并诱导细胞凋亡,其机制可能与调控JAK2/STAT3信号通路并促进活化的Caspase-3蛋白表达有关。

细胞密度与细胞增殖关系的初步分析

目的:探讨细胞密度对细胞克隆形成能力的影响。方法:利用平板克隆形成实验检测五种细胞系BT325、786-0、293、C6和NIH3T3的克隆形成能力,分析细胞密度或细胞数量对这些细胞系的克隆形成能力及细胞周期的影响。结果:细胞密度增加时,明显降低NIH3T3和786-0细胞系中具有克隆形成能力的细胞数,更高的细胞密度才能导致293细胞系的克隆形成能力下降。细胞密度的增加对BT325和C6这两种细胞系的克隆形成能力无明显影响。细胞周期分析表明,细胞密度对于BT325、C6以及293的细胞周期无明显影响,但能明显增加786-0和NIH3T3的G1期细胞比例,减少S期细胞比例。细胞密度可影响这五种细胞系的细胞周期和克隆形成能力,且两者关系密切。结论:可能存在一种与细胞数量相关的因素能抑制干细胞(包括肿瘤干细胞)的扩增。另外,在永生化细胞系中,干细胞的扩增频率与细胞的有丝分裂频率基本一致。

多参数复合分选表皮干细胞的初步实验研究

目的探索多参数分选,以获得高纯度表皮干细胞(humanepidermalstemcells,hESCs)方法的可行性。方法收集3岁～6岁健康幼儿包皮,以DispaseⅡ和Tropsin分离、收集原代表皮细胞(5例),利用流式细胞仪(FACS)分别进行多种参数分选,即:CD49f+/CD71-表型的细胞分选;直径小于10微米的细胞分选。以及多参数复合分选,即:CD49f+/CD71-且细胞直径小于10微米细胞。对各组分选细胞及未分选细胞进行克隆形成率、细胞最大扩增能力、克隆形成面积的检测比较。计算各种分选方法所对应的细胞回收率。结果单参数分选的两组细胞之间在克隆形成率、细胞最大扩增能力、克隆形成面积三方面无统计学差异(p>0.05)。多参数分选得到的细胞与通过单参数分选的两组细胞均存在统计学差异(p<0.05)。结论利用多参数分选,能获得纯度更高的干细胞表型的表皮细胞。

小鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养及鉴定

为了探讨并完善小鼠骨骼肌卫星细胞（satellite cells,SCs）的原代分离培养技术,试验通过对SCs的取材、分离、消化、培养等步骤的改进获得SCs,并应用差速贴壁法进行纯化,从形态学、生长曲线、克隆形成能力、冻存复苏活力、SCs表面标记物的检测、成肌细胞分化能力及RT-PCR鉴定等方面对SCs进行研究。结果表明：分离获得的小鼠骨骼肌SCs呈梭形或纺锤形,细胞饱满且折光性强,生长曲线呈标准的＂S＂型,克隆形成率高达（56.11±1.73）%,冻存复苏后细胞活率为（96.67±0.87）%,表达desmin、c-Met、Myf5、Myo D等SCs表面特异性标记物,成肌细胞诱导分化后能形成多核肌管并表达成肌细胞表面特异性标记物Mylpf。说明小鼠骨骼肌SCs体外培养获得成功。

金粉蕨素抑制人胃腺癌细胞增殖作用

目的：观察金粉蕨素（Onychin）对人胃腺癌MGC－803细胞增殖及克隆形成能力的抑制作用。方法：采用MTT比色分析法测定MGC－803细胞增殖。应用琼脂扩散盒法和平皿琼脂培养克隆形成法检测MGC－803细胞体内外克隆形成能力。结果：金粉蕨素（1．25－20．00μg/ml)对MGC－803细胞增殖有明显抑制作用，IC50值是3．24μg/ml；2．50－20．00μg/ml的金粉蕨素具有显著抑制MGC－803细胞体外克隆形成能力作用，IC50值为4．98μg/ml；2．50－20．00mg/kg的金粉蕨素对MGC－803细胞体内克隆形成能力具抑制作用，呈浓度相关性（P＜0．01）。结论：金粉蕨素对MGC－803细胞增殖及克隆形成能力具有抑制作用。

非整倍体与肿瘤细胞增殖表型关系的初步研究

目的探讨非整倍体与肿瘤细胞增殖表型的关系.方法采用平板克隆形成实验检测人胶质瘤细胞系BT325和大鼠胶质瘤细胞系C6单个细胞的增殖能力,应用常规染色体分析方法检测这些细胞系的核型.结果 BT325和C6细胞系中具有最强增殖能力的细胞分别占8.0%和13.0%左右,具有中等增殖能力的细胞比例分别占17.0%和27.0%,不具有增殖能力或增殖能力很低的细胞分别占75.0%和60.0%.连续细胞克隆形成实验发现,只有具有最强增殖能力的细胞能够连续传代.核型分析结果表明这些细胞系都是非整倍体核型,细胞系BT325的众数范围是47～57,C6的众数范围是32～41,众数范围的细胞比例分别是72.6%和73.4%.结论单纯从非整倍体出发不可能合理解释肿瘤细胞增殖表型的异质性现象,提示有其它机制参与癌变过程.

吉非替尼对胰腺癌细胞克隆形成与体外侵袭能力的影响及机制

吉非替尼是表皮生长因子（EGF）受体酪氨酸激酶抑制剂，能与ATP或酶的底物结合位点作用而影响酶的磷酸化。近期研究表明，吉非替尼对多种肿瘤细胞，例如结肠癌、前列腺癌、乳腺癌的生长有抑制作用。本研究旨在通过体外实验研究，探讨其对胰腺癌细胞的作用，尤其是对胰腺癌细胞的侵袭、体外克隆形成的影响及相关机制。

ASPM对肝癌细胞恶性表型的影响

目的:探讨人类异常纺锤体样小头畸形相关蛋白基因(ASPM)对肝癌细胞恶性表型的影响。方法:将人肝癌细胞株QGY-7703培养于RPMI1640培养液,放置在5%CO_(2)、37℃培养箱中培养。用0.02%EDTA配制的0.1%胰酶消化细胞,取对数生长期细胞进行转染,收集细胞检测目的基因的沉默效率。以ASPM基因沉默的QGY-7703细胞为试验组,以转染空质粒的QGY-7703细胞为对照组。比较两组细胞生长速度、克隆形成能力、细胞周期分布、细胞凋亡比例、细胞迁移数目与侵袭数目。结果:试验组与对照组相比,QGY-7703肝癌细胞的生长速度明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);试验组细胞克隆形成数目为(165.12±10.45)个低于对照组(264.21±12.59)个,差异有统计学意义(P<0.05)。试验组G1/G0期细胞比例高于对照组,S期细胞比例低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),两组G2/M期细胞比例相比差异无统计学意义(P>0.05)。试验组QGY-7703的凋亡水平为(8.10±0.16)%高于对照组的(0.65±0.11)%,差异有统计学意义(P<0.05)。试验组细胞迁移数目与侵袭数目均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:沉默ASPM基因可抑制QGY-7703的增殖能力和克隆形成能力,增加G1期细胞比例、减少S期比例,促进其凋亡,并可抑制肝癌细胞QGY-7703的迁移能力,可作为肝癌治疗的新的分子靶点。

食品和临床来源金黄色葡萄球菌对Caco-2细胞侵袭力的比较研究

目的研究食品和临床来源金黄色葡萄球菌不同克隆系(clonal complex,CC)菌株对Caco-2细胞的侵袭力和菌膜形成能力。方法采用Caco-2细胞体外培养方法、庆大霉素与溶葡萄球菌酶保护试验,研究金黄色葡萄球菌12个不同来源的克隆系菌株对人体肠道表皮细胞的体外侵袭力;采用96孔板结晶紫染色法评估不同菌株的菌膜形成能力。结果体外侵袭能力试验结果表明CC5、CC25、CC30、CC50、CC59、CC239和CC398等克隆系都具有细胞强侵袭株,与牲畜特异相关的CC9也展现出细胞强侵袭力,而CC1、CC20、CC72和CC121等克隆系则明显具有较弱的细胞侵袭能力。不同克隆系菌株菌膜形成的能力也具有一定差异,其中CC5、CC9、CC25和CC239等克隆系菌膜形成能力相比较强,而CC1、CC72、CC59和CC121等则菌膜形成能力较弱。进一步分析发现不同克隆系菌株的菌膜形成能力与细胞侵袭力呈现正相关(R=0.743)。结论金黄色葡萄球菌不同克隆系菌株的细胞侵袭能力、菌膜形成能力具有一定差异,为有效防控金黄色葡萄球菌临床感染提供重要支持。

阻断BMK1通路可通过调控BNIP3和BNIP3L抑制肿瘤干细胞

肿瘤干细胞（CSCs）具有干细胞相关的许多特性,并被认为可操控肿瘤的发生。尽管靶向CSCs具有开发新药物的巨大潜力,但由于目前缺乏有效的药物靶点和合适的药理学制剂,其发展仍有很大障碍。Song等的研究结果表明,BMK1的磷酸化不仅与胚胎干细胞和诱导性多能干细胞有关,也与CSCs有关。通过表达MEK5D激活BMK1,可增强CSCs的自我更新（微球体形成实验证实之）、增殖（克隆形成实验证实之）和成瘤能力,而BMK1抑制剂XMD8-92能抑制上述过程。

成釉细胞瘤发病机制的最新概念

成釉细胞瘤是一个可造成局部破坏和侵袭的肿瘤,尽管手术切除范围足够大,但复发率仍较高。分子学研究提供了许多关于成釉细胞瘤发病机制的有趣发现。该文在以下方面讨论成釉细胞瘤的分子性质，包括克隆形成能力、细胞增殖、凋亡、肿瘤抑制基因、免疫组化、釉基质蛋白、破骨机制、基质金属蛋白酶以及一些信号分子。