转基因甘蔗BtG-2的T-DNA侧翼序列分析及其转化事件特异性检测

转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明:Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。

基于重测序鉴定耐盐转基因大豆事件外源T-DNA整合位点及特异性检测

[目的]转基因大豆事件L8014是本研究前期利用农杆菌介导的大豆子叶节高效遗传转化技术体系,将来源于山菠菜的基因BADH导入大豆(Glycine max)‘Williams 82’而获得具有良好耐盐(1.5%NaCl)性状的转基因大豆(该材料已经完成环境释放试验)。T-DNA插入位点侧翼序列的获得与分析对于转基因事件的安全评价及应用非常重要,本文旨在明确该转基因大豆材料的分子特征及其检测方法,以进一步推进安全评价。[方法]利用Southern杂交检测转基因大豆外源基因的拷贝数;基于基因组重测序技术,采用BWA(Burrows-Wheeler-Alignment)方法将重测序数据与T-DNA序列以及大豆基因组序列进行比对分析。[结果]T-DNA在大豆基因组10号染色体上的基因组区间3925017—3926022位点,插入方式为反向插入;结合PCR扩增技术获得外源T-DNA整合位点的左、右边界侧翼序列,基于该序列建立了转BADH基因大豆事件L8014的特异性PCR检测方法。[结论]本研究获得了转基因事件的整合位点及侧翼序列,方法快速、结果可靠,为转基因大豆及其衍生产品的检测提供了技术支撑。

蓝猪耳启动子捕获系统的建立

为了分离基因启动子,构建了陷阱植物表达载体pHAHCA,用农杆菌介导的无启动子GUS方法转化蓝猪耳,经抗性筛选和PCR检测,获得82株转基因植株,转化率达12.5%。12株GUS染色呈阳性,其中10株GUS在叶脉表达,2株在茎和叶脉表达。对转基因植株进行盐胁迫处理,有1株根部出现GUS染色蓝色斑点。通过TAIL-PCR扩增和测序,获得5个T-DNA侧翼序列。

转Cry1Ac-2A-gna基因甘蔗BCG-17转化体特异性检测方法的建立

转基因作物外源T-DNA插入的侧翼序列是转基因事件检测的关键组分,也是转基因作物生物安全评价和监管所必需提供的重要信息。为了明确抗虫转基因甘蔗BCG-17的分子特征和建立其事件特异性检测方法,推进其生物安全性评价工作及未来的监管工作,以其T2代为研究材料,通过Southern 杂交检测外源基因在甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立该转化体的高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明:Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BCG-17株系;经过3-4次的热不对称PCR扩增,分离到510 bp的T-DNA左侧翼序列和915 bp的右侧翼序列;以此为基础,分别设计左右侧翼检测引物,建立了BCG-17株系的转化事件特异性PCR检测方法,左侧翼的PCR检测方法特异性强、灵敏度高,检出极限为0.1%,相当于9个单倍体甘蔗基因组拷贝数。转基因株系BCG-17的分子特征及其转化事件特异性检测的完成,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供了技术依据。