微生物生态学中分子生物学方法及T-RFLP技术研究

根据微生物基因 (DNA)多态性来研究微生物的多样性 ,是建立在多聚酶链式反应 (PCR)基础之上分子生物学的新方法 ,克服了传统微生物培养方法的限制。从理论、实验及应用角度出发 ,介绍了几种在微生物生态学中应用较为广泛的分子生物学技术 ;详细阐述了微生物生态学中分子生物学的一种新研究方法———末端限制性片段长度多态性 (T -RFLP)技术 ,该技术作为一种研究微生物群落特征的理想方法已经越来越受到人们的重视。

应用T-RFLP技术分析不同土壤温度和施肥方式下设施土壤细菌群落结构

采用末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)和荧光定量PCR技术,研究了两种土壤温度(对照不增温,10°C ±2°C;增温,20°C ±2°C)和两种施肥方式(对照不施肥;鸡粪有机肥底肥+尿素追肥)对土壤细菌群落结构及其多样性和数量特征的影响。结果表明:相同施肥方式下,土壤增温增加土壤速效养分含量,尤其在施肥时增加幅度更明显。分析显示施肥对土壤细菌群落结构的影响在不同土壤温度条件下表现不同。土壤不增温条件下,施肥增加细菌Pielou均匀度指数和Shannon-Weiner多样性指数,Simpson优势度指数降低;土壤增温条件下,则效果相反。与不增温比,增温使土壤细菌Pielou均匀度指数和Shannon-Weiner多样性指数降低,但物种个体数和Simpson优势度指数增加明显。增温改变了土壤细菌群落结构,62 bp和93 bp两种限制性末端片段在土壤增温条件下优势度提高,主要包括共生菌和杆菌。

应用T-RFLP技术分析滇池污染水体的细菌群落

为确定重富营养化湖泊——滇池水体的主要细菌类型与种群结构,本研究运用末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术分析了滇池水体9个样点的细菌群落特征及多样性.对各样本的T-RFLP谱图进行聚类分析,结果表明不同地理位置的污染物浓度差异可能是造成细菌群落差异的主要原因.研究同时结合克隆文库技术对各样本T-RFLP谱图中的末端限制性片段(T-RFs)进行了分析,通过建立T-RFs长度与细菌种属的对应关系,确定这9个样点的优势菌组成主要为Pseudomonas属、Aphanizomenon属和Rhodobacter属.

属特异性T-RFLP技术用于乳酸杆菌的群落分析

【目的】设计乳酸杆菌属特异性T-RFLP技术(末端限制性片段长度多态性分析)对14株乳酸杆菌进行分型。【方法】采用源于16S-23S rRNA基因间隔区序列的乳酸杆菌属特异性引物LAB-rev,乳酸杆菌的属特异性引物,6-FAM荧光标记后结合16S上游通用引物7f用于乳酸杆菌的PCR扩增。【结果】选取HaeⅢ和HhaⅠ进行限制性酶切,最后对酶切后的产物末端测序得到T-RFLP峰谱图,该图谱能够快速准确地对不同种的乳酸杆菌进行定性、定量的分析。【结论】实验成功搭建T-RFLP技术用于微生态环境中乳酸杆菌检测的平台,对于在功能性食品、乳酸饮料和药物对肠道微生态的影响及菌种鉴定等领域有重大意义。

属特异性T-RFLP技术在双歧杆菌群落分析中的应用

【目的】以双歧杆菌标准菌株为材料,构建双歧杆菌属特异性末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)技术,用于微生物群落中双歧杆菌的特异性分析。【方法】采用16S rRNA基因的双歧杆菌属特异性引物,5′-端用HEX荧光标记,结合通用引物1510r进行双歧杆菌特异性PCR扩增,软件模拟酶切后选取Hae III和Alu I进行限制性酶切,对酶切消化产物的荧光标记末端测序得到T-RFLP峰谱图。同时将该技术与实验室已建立的乳酸杆菌属特异性T-RFLP技术相结合,建立多相T-RFLP技术应用于对市面上益生菌产品的时效性检测。【结果】建立的方法能够快速准确地对不同种的双歧杆菌及合生元产品中的益生菌进行定性或半定量分析。【结论】据此,成功搭建T-RFLP技术用于微生态环境中双歧杆菌的检测,并成功将多相T-RFLP技术用于市售益生菌产品的时效性检测。

T-RFLP分析技术在肉鸡肠道微生物研究中的应用

本文阐述了末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)分析技术的基本原理和技术路线,讨论了应用T-RFLP分析技术相对于应用传统方法研究肉鸡肠道微生物的优势,总结了应用T-RFLP分析技术研究肉鸡肠道微生物的发展历程,分析了应用T-RFLP分析技术研究肉鸡肠道微生物存在的问题及解决方法,并对其应用前景进行了展望。

基于T-RFLP和因子分析的香蒲根际细菌群落研究

以北京市永定河王平湿地为研究对象,应用末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)对王平湿地再生水补水口及其远离补水口的香蒲根际细菌和氨氧化细菌(AOB)的群落结构及多样性变化进行分析,在此基础上结合MiCA3比对、典范对应分析(CCA)和多元统计中因子分析(FA),解析湿地不同空间细菌群落功能特性的变化.结果显示再生水补水口细菌群落各多样性指数均明显低于远离补水口细菌群落,而氨氧化细菌群落则呈现相反趋势.基于传统的T-RFLP片段MiCA3比对、CCA和FA相结合的分析表明:对细菌群落,占再生水补水口细菌群落总丰度55.6%的菌群与150bp代表的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)具相似净化功能,并与总有机碳生物化学循环过程具密切关系,其次占再生水补水口上游细菌群落总丰度75.5%的菌群与81bp为代表的假单胞菌属(Pseudomonas sp.)和Geitlerinema sp.具相似净化功能,并与氮的生物化学循环过程具密切关系.占再生水补水口下游细菌群落总丰度68.7%的菌群与138bp代表的小单孢菌属(Micromonospora sp.)具相似净化功能,同时与重金属Cu、V、和Ti生物化学循环具密切关系.对氨氧化细菌,266bp受铵态氮影响较大,占再生水补水口氨氧化细菌群落总丰度65.5%的菌群与266bp代表的Nitrosomonas sp.具相似的生境特征,适合在高氨环境中生长;与58bp所代表的Nitrosospira sp.具相似功能特性菌群丰度在远离补水口样点中较前者呈现显著增加趋势,表征该类菌群适合在相对低氨环境中生长.

太湖梅梁湾不同深度沉积物中细菌群落结构组成

为研究湖泊沉积物不同深度处的细菌群落结构组成和多样性,选取太湖梅梁湾作为采样点,应用末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术比较湖泊不同深度沉积物样品中细菌群落的结构组成及其多样性。结果表明:太湖沉积物中细菌具有丰富的多样性,细菌种类和相对丰度与当前已有的可培养细菌研究结果一致。细菌群落结构随着沉积物深度的增加呈现一定的变化规律,相邻近的沉积物分层中细菌群落结构的相似度较高;随着沉积物深度的增加,沉积物中优势菌属发生了一定的变化;表层沉积物与底层沉积物的细菌群落结构相差较大。鉴于氧含量随着沉积物深度的增加而逐渐减少,可以推断氧含量的变化是造成湖泊沉积物中细菌群落结构与多样性差异的主要原因。另外,表层沉积物中的生物扰动也是可能的原因。

洪泽湖3种沉水植物附着细菌群落结构及多样性

沉水植物茎叶表面附着的藻、菌及其他物质,不仅影响沉水植物自身生长,而且影响水体物质循环过程,附着藻类的研究已经有不少报道,但附着细菌的报道相对较少.采用末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术,研究洪泽湖典型沉水植物——菹草(Potamogeton crispus)、篦齿眼子菜(Potamogeton pectinatus)、金鱼藻(Ceratophyllum demersum)在生长旺盛期叶表面附着细菌的群落结构及多样性特征,并采用冗余分析法探讨环境因子对附着细菌丰度的影响.结果表明,(1)3种沉水植物附着细菌群落结构有明显的差异性.143 bp T-RF在菹草和篦齿眼子菜中的相对丰度平均达到了20%和11%,而在金鱼藻中的相对丰度小于1%;89 bp T-RF在金鱼藻中的相对丰度平均约为13%,而在菹草和篦齿眼子菜中相对丰度小于5%.94 bp T-RF在菹草样品中相对丰度超过15%,而在其他样品中未被检测出.(2)从多样性角度分析,3种沉水植物附着细菌多样性大小依次为篦齿眼子菜>菹草>金鱼藻.(3)部分限制性片段的丰度受环境因子的影响较大,如89、94、143和227 bp T-RFs.而如167 bp T-RFs在3种沉水植物中的相对丰度分布较为稳定,受上述环境因子的限制较小.根据细菌比对结果,洪泽湖附着细菌的优势菌群可能属于拟杆菌门(Bacteroides)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)3个门类.

五氯苯酚厌氧生物降解及降解体系中细菌种群结构分析

研究了不同外加碳源作为共代谢基质及氢气作为电子供体条件下PCP的厌氧生物降解特性,并借助末端限制性片段长度多态性技术(T-RFLP)分析了PCP降解菌群的微生物群落结构。结果表明,添加外加碳源及以氢气作为电子供体均对PCP降解有显著促进作用。添加葡萄糖、丙酮酸、酵母膏和氢气时的降解率分别为71%、56%、51%和74%。微生物群落结构分析表明,不同处理条件下PCP降解菌群微生物群落结构不同。PCP降解菌群中可能存在Clostridium、Frankia和Desulfitobacterium等属的微生物。

内蒙古高原干涸湖泊反硝化及甲烷氧化细菌的群落分析

以内蒙古高原半干旱草原区干涸湖泊为研究对象,应用末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术对湿地土壤中的反硝化和甲烷氧化关联菌群的关键功能基因nosZ和pmoA进行了研究,根据末端限制性片段(T-RFs)分析了两种菌群的群落结构及多样性变化,以及环境因素所产生的影响,并探讨了土壤微生物群落对湖泊干涸的响应机制.结果表明:干涸湖泊的湖心、湖底土壤反硝化和甲烷氧化细菌多样性指数较高,群落结构较复杂;而较早干涸的湖坡以及相邻草原对照区,两个菌群多样性指数较低,群落结构相对单一.从湖心到相邻草原,反硝化和甲烷氧化细菌的群落相似度逐渐降低,显示两个菌群处于动态演替中.湖泊干涸过程中,水分含量和有机质含量对反硝化和甲烷氧化细菌的群落结构影响显著;高pH值和高铵态氮分别对反硝化和甲烷氧化细菌有抑制作用.随着湖泊干涸,土壤微生物群落因环境扰动而受到胁迫,这一过程会加剧CO2等温室气体的排放.

阳澄湖与太湖微生物多样性与群落结构研究

以不同季节的阳澄湖、太湖的水样和底泥为研究对象,采用PCR、T-RFLP技术结合的方式研究了两湖水样和底泥中微生物多样性与群落结构,从微生物角度出发分析引发阳澄湖、太湖养殖的螃蟹重大差异的原因。结果表明:春季两湖水体环境中微生物群落结构差异不显著,底泥环境中微生物群落结构差异甚大,夏季两湖水体中的微生物群落结构跟春季相比都发生了较大变化,底泥相比春季变化不大。阳澄湖水样的细菌群落优势度高于太湖水样,群落内物种分布相对均匀,其物种多样性也较高。可能由于两湖水体微生物和底泥微生物种群和多样性的差异,影响了蟹的生长环境与营养,从而导致了两湖蟹养殖上的差异,即阳澄湖水体与底泥微生物为螃蟹的养殖与生长提供了更为良好的环境。

我国南方典型水稻土中甲烷氧化细菌群落分布研究

甲烷氧化细菌以甲烷为其唯一的碳源和能源,在全球大气甲烷平衡中起着重要的作用。水稻土作为主要的甲烷的源和汇,其中分布大量的甲烷氧化细菌。文章通过利用T-RFLP技术发现我国干杉、广州、重庆、江都及进贤五地的水稻土中的甲烷氧化细菌主要的种群是甲基球菌属(Methylococcus)、甲基微球菌属(Methylomicrobium)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、甲基杆菌属(Methylobacter);五个地区水稻土的土壤中的甲烷氧化细菌分布存在差异,江都水稻土中甲烷氧化细菌种群类型较多,重庆水稻土中甲烷氧化细菌种群多样性指数最大。

渭河浮游细菌群落结构特征及其关键驱动因子

基于T-rflp技术和高通量测序技术,分析了渭河在平水期、枯水期和丰水期的浮游细菌群落变化特征,并采用冗余分析和典范对应分析识别了不同水文时期影响细菌群落的关键环境因子.结果表明,渭河水体浮游细菌群落空间和季节差异明显,且季节性差异比空间差异更加显著.平水期、枯水期和丰水期渭河(陕西段)干流浮游细菌群落Shannon多样性指数分别在2.13~2.82、2.05~2.84和2.61~2.91之间.平水期浮游细菌多样性指数空间差异最大(RSD=16.75%),样点间群落结构相似度最低(26.8%),流域优势T-RF片段数最多(23种);丰水期浮游细菌Shannon指数空间差异最小(RSD=9.27%),样点间群落相似度最高(62.6%),且检出的优势片段数最少(12种).咸阳-西安段是浮游细菌群落多样性最低、优势菌群结构最单一的河段.河流水体细菌群落在不同时期的关键环境驱动因子不同,而其中悬浮颗粒物(TSS)浓度是不同水文时期都不可忽视的关键影响因子.高通量分析结果表明,丰水期渭河水体浮游细菌物种涉及21个已知细菌门类和26个候选门类,其中,变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)共同的相对丰度占比达到75%以上,是最主要的细菌类群.汛期渭河干流各样点浮游细菌群落特征趋于一致,物种结构与泾河相似而与黑河存在明显差异.

水稻土中铁还原菌多样性

微生物介导的异化Fe(III)还原是非硫厌氧环境中Fe(III)还原生成Fe(II)的主要途径,然而相关的铁还原菌还不是很清楚,特别是在水稻土中.本文采用富集培养的方法,以乙酸和氢气作为电子供体,水铁矿和针铁矿作为电子受体,通过末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术和16SrRNA基因克隆测序相结合的分子生物学方法研究了水稻土中铁还原菌的多样性.结果表明:无论是以乙酸或氢气为电子供体,水铁矿或针铁矿为电子受体,地杆菌(Geobacter)和梭菌(Clostridiales)是富集到的主要微生物群落;乙酸为电子供体时,富集到的主要微生物群落还包括红环菌(Rhodocyclaceae);因此,除地杆菌外,梭菌和红环菌很可能也是水稻土中重要的铁还原菌.

城市污水处理厂活性污泥中氨氧化菌群落结构研究

为了解析污水处理厂中氨氧化菌(AOB)的群落结构,以及处理工艺、规模等参数对AOB群落结构的影响,采用针对AOB功能基因氨单加氧酶(amoA)的末端限制性片段长度多态性技术(T-RFLP)、克隆测序等方法,研究了北京市6个污水处理厂的9个污水处理系统中AOB的群落结构.T-RFLP指纹图谱表明不同污水处理系统中AOB的群落结构有所不同,主要的末端限制性片段(T-RF)为354、491和291 bp.T-RFLP指纹图谱及聚类分析表明,污水处理工艺对系统中AOB的群落结构影响较小,而处理规模对AOB的群落结构有一定的影响.对功能基因amoA的系统发育分析表明,污水处理系统中优势AOB均为Nitrosomonasspp.,而非Nitrosospiraspp..这可能是Nitrosomonasspp.的最大比增长速率(μmax)较高,使其更容易成为活性污泥系统中的优势AOB.

不同规模污水处理系统中微生物群落结构

为了研究处理规模对污水处理系统中微生物群落结构的影响,该文采用针对氨氧化菌(AOB)功能基因氨单加氧酶(amoA),及针对细菌16S rRNA基因的末端限制性片段长度多态性技术(T-RFLP),分析了北京市一个实际污水处理系统和一个中试反应器中AOB及细菌的群落结构,并探讨了处理规模对微生物群落结构的影响。T-RFLP指纹图谱表明:2个污水处理系统中AOB的优势末端限制性片段(T-RF)均为291和354 bp,细菌的优势T-RF为106、115、117、166、423、455、468、471、482、739、777和782bp等。T-RFLP指纹图谱分析表明:处理规模对系统中AOB群落结构没有显著影响,而对系统中细菌的多样性有一些影响。2个污水处理系统中优势AOB均属于Nitrosomonas europaeacluster和Nitrosomonas oligotrophaculster。

连作对马铃薯根际土壤细菌群落结构的影响

本研究利用末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)分析技术,对长期施肥与不施肥的连作马铃薯根际土壤细菌群落结构与功能进行研究。结果表明连作马铃薯在长期施肥与不施肥下,根际土壤细菌群落种类和数量发生显著变化,与对照土壤(CK)相比,有益细菌种类和数量均增加,但长期不施肥土壤中有害细菌数量高于长期施肥土壤。与长期不施肥相比,长期施肥对土壤养分利用率较高,与土壤细菌群落种类和数量PS>PNS>CK的变化趋势相一致。因此,连作马铃薯在长期施肥条件下,在一定程度上可以改善土壤养分状况,促进土壤有益微生物的活动,减少根际产生致病菌,但不能从根本上消除马铃薯连作障碍,可能还与其根系分泌物密切相关。今后可对根际土壤微生物、土壤养分和根系分泌物等土壤生态因子之间进行综合研究,从根本上解决马铃薯连作障碍。

非培养法研究成年CF患者长期呼吸道菌群的变化特点

目的研究成年肺囊性纤维化(cystic fibrosis,CF)患者1年内呼吸道菌群的变化特点。方法收集9例已确诊的CF患者痰液标本,平均每月1次,共1年,同时记录患者一般临床状态。对痰液标本分别进行传统细菌培养和16S rRNA测序确定样本中的菌种。根据基因测序确定的菌种结果分析患者1年内呼吸道菌群的变化特点,及其可能与患者的临床状态间的关系。结果通过非培养方法检测到的菌种和临床状态之间无显著相关性。研究初期发现的菌种数量和后续新菌种的获得率之间没有显著关系(所有患者的成对皮尔森相关,P=0.631,r2=0.5)。反Bray-Curtis相似性指数评估在12月内群落组成的总体变化,CF患者之间细菌菌群的变化是不同的,每个患者菌群平均丰度与其时间的变化间无相关性(皮尔森相关P=0.252,R=0.389)。采用DDR检测样本间的相似性是否完全由于样本收集间的时间间隔造成,结果显示1个受试者的距离衰减关系差异有统计学意义(患者5,P=0.041),其他受试者的结果两个采样点的菌落组成与采样的时间间隔没有显著关系,这表明上述观察到的菌落稳定性并非是一个简单的采样频率函数。结论成年CF患者的呼吸道菌群尽管彼此有差异,但各自的长期定植菌群构成相对稳定,不易受呼吸道感染和抗生素应用的影响。