三氧化二砷对淋巴瘤T2细胞株SHP-1基因的去甲基化作用

背景与目的:去甲基化作用可能是三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)对抗造血系统恶性肿瘤的另一种机制。本研究探讨As2O3对淋巴瘤细胞系T2细胞中抑癌基因酪氨酸磷酸酶(SH2-containinphosphatase-1,SHP-1)的去甲基化作用及对T2细胞生长增殖的生物学影响。方法:T2细胞以As2O3或5-氮杂胞苷(5-aza-2'-deoxyoytidine,5-AC)单独处理,或两药联合处理。采用甲基化特异性PCR、荧光定量PCR和Western检测As2O3处理前后SHP-1基因启动子过甲基化及其mRNA和蛋白表达状况、c-kit蛋白表达变化。MTT法检测细胞存活率。流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:As2O3能逆转SHP-1基因启动子甲基化,使T2细胞SHP-1mRNA和蛋白重新表达,同时c-kit蛋白表达呈下降趋势;As2O3明显抑制T2细胞的增殖,随浓度增加及作用时间延长,其增殖抑制效应增加(P<0.05);2.5μmol/L浓度的As2O3作用T2细胞1,2,3d细胞增殖抑制率(9.8%,20.3%,47.5%)明显低于联合作用组(11.0%,36.7%,61.0%)。As2O3可使T2细胞凋亡率增加,且随作用时间延长和浓度增加,凋亡细胞逐渐增多(P<0.05),联合作用组细胞凋亡率(1d:17.3%;2d:37.9%;3d:67.9%)明显高于2.5μmol/LAs2O3单独作用组(6.1%,26.5%,50.9%)。结论:As2O3能去除T2细胞中SHP-1基因甲基化,使其重新表达,并可能通过抑制c-kit受体及其信号转导路径的活化而抑制肿瘤细胞增殖,并诱导细胞凋亡。

系统性红斑狼疮患者血清miR-125b-5p水平与Th1/Th2细胞、Th17/Treg细胞失衡的相关性

目的探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者血清微小核糖核酸-125b-5p(miR-125b-5p)水平与辅助性T细胞(Th)1/Th2、Th17/调节性T细胞(Treg)失衡的相关性。方法选取2021年1月至2023年1月该院收治的88例SLE患者作为SLE组,另选取同期在该院体检的29例体检健康者作为对照组。SLE组根据疾病活动程度分为轻度组、中度组和重度组。检测所有研究对象血清miR-125b-5p水平和外周血Th1、Th2、Th17、Treg细胞比例。采用Spearman相关分析SLE患者血清miR-125b-5p水平与SLE疾病活动程度之间的相关性,外周血Th1、Th2、Th17、Treg细胞比例及Th1/Th2细胞、Th17/Treg细胞比值与SLE疾病活动程度之间的相关性。采用Pearson相关分析SLE患者血清miR-125b-5p水平与外周血Th1、Th2、Th17、Treg细胞比例及Th1/Th2细胞比值、Th17/Treg细胞比值之间的相关性。结果SLE组血清miR-125b-5p水平及外周血Th2、Treg细胞比例均低于对照组(P<0.05),外周血Th1、Th17细胞比例和Th1/Th2细胞、Th17/Treg细胞比值均高于对照组(P<0.05)。SLE患者轻度组35例、中度组30例、重度组23例。血清miR-125b-5p和外周血Th2、Treg细胞比例表现为轻度组>中度组>重度组,外周血Th1、Th17细胞比例和Th1/Th2细胞、Th17/Tre细胞比值表现为轻度组<中度组<重度组,且任意两组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。Spearman相关分析结果显示,SLE患者血清miR-125b-5p水平与SLE疾病活动程度呈负相关(r=-0.811,P<0.001),外周血Th1、Th17细胞比例及Th1/Th2细胞、Th17/Treg细胞比值与SLE疾病活动程度呈正相关(r=0.728、0.786、0.812、0.808,P<0.001),外周血Th2、Treg细胞比例与SLE疾病活动程度呈负相关(r=-0.811、-0.723,P<0.001)。Pearson相关分析结果显示,SLE患者血清miR-125b-5p水平与外周血Th1、Th17细胞比例及Th1/Th2细胞、Th17/Treg细胞比值呈负相关(r=-0.801、-0.781、-0.816、-0.819,P<0.001),与外周血Th2、Treg细胞比例呈正相关(r=0.845、0.812,P<0.001)。结论SLE患者血清miR-125b-5p水平降低,能通过调节Th1/Th2细胞、Th17/Treg细胞平衡参与SLE的发生、发展。

梅毒血清固定患者中NOD样受体蛋白3和Toll样受体4表达与Th1/Th2相关细胞因子的相关性研究

目的探究梅毒血清固定患者中NOD样受体蛋白3(NLRP3)、Toll样受体4(TLR4)表达与辅助性T细胞1/辅助性T细胞2(Th1/Th2)相关细胞因子的相关性。方法选取2021年2月至2022年4月川北医学院附属三台医院收治的197例梅毒患者作为研究对象。将进行驱梅治疗后血清转阴者纳入转阴组(n=88),未进行驱梅治疗者纳入梅毒组(n=45),接受驱梅治疗后血清固定者纳入固定组(n=64)。另选取同期进行体检的健康人作为对照组(n=53)。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测外周血单个核细胞(PBMCs)中NLRP3、TLR4 mRNA相对表达水平;采用酶联免疫吸附试验法检测Th1/Th2相关细胞因子的表达水平;采用Pearson法分析TLR4、NLRP3 mRNA与Th1/Th2相关细胞因子的相关性。结果各组PBMCs中TLR4、NLRP3 mRNA表达水平比较,梅毒组>转阴组>对照组>固定组,差异具有统计学意义(P<0.05);各组白介素(IL)-2、γ干扰素(IFN-γ)水平比较,对照组>转阴组>梅毒组>固定组,差异具有统计学意义(P<0.05);各组IL-1β、IL-4、IL-10及IL-18水平比较,对照组<转阴组<梅毒组<固定组,差异具有统计学意义(P<0.05);梅毒血清固定患者TLR4、NLRP3 mRNA表达与IFN-γ、IL-2呈正相关,与IL-1β、IL-4、IL-10、IL-18呈负相关(P<0.05)。结论梅毒血清固定患者NLRP3、TLR4 mRNA表达水平显著降低,且与Th1/Th2相关细胞因子密切相关。

IGF-1介导MAPKs通路在C3H10T1/2细胞成骨分化中的作用

目的探究胰岛素样生长因子1(IGF-1)介导丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路在C3H10T1/2细胞成骨分化中的调控作用及机制。方法不同浓度IGF-1(0、5、10、20 ng/mL)培养C3H10T1/2细胞,碱性磷酸酶(ALP)与茜素红(ARS)染色检测ALP活性、钙盐沉积情况,qRT-PCR法检测成骨特性因子核心结合因子α-1(RUNX2)、成骨分化特异性因子骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)mRNA表达水平,Western Blot法检测MAPK通路蛋白磷酸化表达水平。对数期细胞分为空白组、IGF-1组、ERK通路抑制剂(PD98059)组、PD+IGF-1组、p38通路抑制剂(SB202192)组、SB+IGF-1组,qRT-PCR法检测成骨特性因子RUNX2、成骨分化特异性因子骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)mRNA表达水平。结果不同浓度IGF-1组ALP显色加深,ALP活性升高,钙盐结节形成增多,RUNX2、OPN、OCN mRNA表达水平升高,磷酸化ERK、p38、JNK蛋白表达增加,具有剂量效应(P<0.05)。与空白组比较,PD组、SB组C3H10T1/2细胞RUNX2、OPN、OCN mRNA表达水平明显降低(P<0.05),PD+IGF-1组、SB+IGF-1组C3H10T1/2细胞RUNX2、OPN、OCN mRNA表达水平明显升高(P<0.05);但与IGF-1组比较,PD+IGF-1组、SB+IGF-1组C3H10T1/2细胞RUNX2、OPN、OCN mRNA表达水平明显降低(P<0.05)。结论IGF-1促进C3H10T1/2细胞成骨分化,其作用机制可能与激活ERK信号通路和p38 MAPK信号通路有关。

CC类趋化因子受体2、Th1/Th2细胞在IgA肾病大鼠肾间质纤维化中的表达及意义

目的检测IgA肾病大鼠肾间质纤维化中CC类趋化因子受体2(C-C motif chemokine receptor 2,CCR2)的表达和辅助性T细胞1/2(helper T cell 1/2,Th1/Th2)的含量,并观察其在肾脏纤维化中的作用。方法40只SD雄性大鼠,随机分为模型组和对照组,每组20只。采用脂多糖+改良牛血清白蛋白+四氯化碳法构建免疫球蛋白A(IgA)肾病模型。观察大鼠肾组织病理改变和IgA沉淀,计算胶原纤维占肾组织百分比,采用Katafuchi评分标准评估肾小管间质损伤程度。蛋白质印迹测定肾组织CCR2水平。双抗体夹心酶联免疫吸附法测定血清白细胞介素-4(IL-4)和干扰素-γ(IFN-γ)水平。流式细胞术检测Th1/Th2细胞比例。结果模型组大鼠肾组织胶原纤维面积百分比和Katafuchi评分显著高于对照组(P<0.05);模型组大鼠肾组织CCR2、血清IL-4水平、Th2细胞含量及IL-4/IFN-γ比值显著高于对照组,血清IFN-γ水平、Th1细胞含量显著低于对照组(P<0.05);CCR2和IL-4水平及IL-4/IFN-γ比值与胶原纤维面积百分比、Katafuchi评分呈正相关(P<0.05);IFN-γ水平与胶原纤维面积百分比、Katafuchi评分呈负相关(P<0.05)。结论CCR2和Th1/Th2失衡参与IgA肾病大鼠肾间质纤维化发生和发展,拮抗CCR2和调节Th1/Th2平衡有可能减轻IgA肾病大鼠肾脏纤维化改变。

不同中医证型特应性皮炎患者外周血Th1、Th2、Th17细胞及miR-155表达分析

目的:分析研究不同中医证型特应性皮炎(AD)患者外周血辅助性T细胞1(Th1)、Th2、Th17细胞及微小RNA-155(miR-155)表达。方法:回顾性选取2021年6月~2022年6月我院收治的AD患者作为AD组(n=112),根据不同中医证型将患者分为脾虚湿蕴组(n=46)、湿热内蕴组(n=37)和血虚风燥组(n=29),另选60例本院同期体检健康人群为对照组(n=60)。比较各组外周血Th1、Th2、Th17细胞百分比差异、Th1类细胞因子(IFN-γ)、Th2类细胞因子(IL-4)、Th17类细胞因子(IL-17)及miR-155表达。结果:AD组外周血Th1、IFN-γ水平低于对照组,Th2、Th17、IL-4、IL-17、miR-155表达均高于对照组(P<0.05);不同中医证型的AD患者外周血Th1、IFN-γ水平比较差异无统计学意义(P>0.05);不同中医证型的Th2、Th17、IL-4、IL-17表达水平相比,湿热内蕴组>脾虚湿蕴组>血虚风燥组(P<0.05);不同中医证型的miR-155表达水平相比,湿热内蕴组>脾虚湿蕴组>血虚风燥组(P<0.05)。结论:不同中医证型AD患者外周血Th2、Th17细胞及相关细胞因子与miR-155表达存在差异性,检测其表达水平有助于指导AD中医辨证分型和治疗。

外周血Th1/Th2细胞因子与急性缺血性脑卒中患者脑功能损伤和认知功能障碍的关系

目的探讨外周血辅助性T细胞(Th)1/Th2细胞因子与急性缺血性脑卒中(AIS)患者脑功能损伤和卒中后认知功能障碍(PSCI)的关系。方法选取AIS患者125例(AIS组)和同时段65例健康人(对照组),AIS患者根据美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分分为轻度脑功能损伤组(33例)、中度脑功能损伤组(74例)和重度脑功能损伤组(18例),根据6个月后是否发生PSCI分为PSCI组(52例)和非PSCI组(73例)。采用流式细胞术检测外周血Th1、Th2比例,酶联免疫吸附法检测血清干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-4。通过Spearman相关性分析AIS患者外周血Th1/Th2细胞因子与NIHSS评分的相关性,单因素和多因素Logistic回归分析AIS患者PSCI的影响因素。结果AIS组外周血Th1、IFN-γ、Th1/Th2水平高于对照组,外周血Th2、IL-4水平低于对照组(P均<0.05)。轻度脑功能损伤组、中度脑功能损伤组、重度脑功能损伤组外周血Th1、IFN-γ、Th1/Th2依次升高,外周血Th2、IL-4水平依次降低(P均<0.05)。AIS患者外周血Th1、IFN-γ、Th1/Th2与NIHSS评分呈正相关,Th2、IL-4与NIHSS评分呈负相关(P均<0.05)。PSCI组年龄大于非PSCI组,NIHSS评分和Th1、IFN-γ、Th1/Th2高于非PSCI组,Th2、IL-4水平低于非PSCI组(P均<0.05)。NIHSS评分增加、Th1升高、IFN-γ升高、Th1/Th2升高为AIS患者PSCI的独立危险因素,Th2升高、IL-4升高为独立保护因素(P均<0.05)。结论外周血Th1/Th2细胞因子与AIS患者脑功能损伤加重和PSCI发生密切相关。

Th1/Th2、Th17/Treg型细胞因子群在稽留流产病因学中的研究进展

近年来稽留流产发病率逐年上升,然病因复杂,免疫相关因素是其病因学研究的热点。妊娠被看作是一次成功的同种异体移植,母体对胎儿形成免疫耐受,但母胎界面免疫微环境的任何失衡都可能导致妊娠失败。辅助型T细胞1(Th1)/辅助型T细胞2(Th2)、辅助型T细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)细胞因子共同构成的细胞因子网络对维持母胎界面免疫微环境的平衡至关重要,该文以Th1/Th2、Th17/Treg型细胞因子群为中心,对其在稽留流产病因学领域的研究概况进行综述。

外周血EETs水平与咳嗽变异性哮喘患儿Th1和Th2及其细胞因子、小气道功能的相关性分析

目的探讨外周血嗜酸性粒细胞胞外诱捕网(EETs)水平与咳嗽变异性哮喘(CVA)患儿的辅助性T淋巴细胞(Th)1和Th2及其细胞因子、小气道功能的相关性。方法选取2019年10月至2022年10月重庆市开州区人民医院收治的95例CVA患儿为CVA组,选取同期于该院儿科保健门诊体检的67例健康儿童为对照组。检测外周血中形成EETs的嗜酸性粒细胞(EOS)百分比、Th1和Th2细胞占比、Th1/Th2比值、血清Th1和Th2细胞因子[白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-6、干扰素(IFN)-γ]水平及小气道功能[25%、50%、75%肺活量的最大呼气量(FEF25%、FEF50%、FEF75%)和最大中期呼气流速(FEF25%~FEF75%)]。分析外周血形成EETs的EOS百分比与Th1和Th2及其细胞因子、小气道功能的相关性,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析外周血形成EETs的EOS百分比诊断CVA的价值。结果CVA组外周血形成EETs的EOS百分比明显高于对照组[(20.35±6.09)%vs.(6.32±1.28)%,t=18.554,P<0.05]。CVA组Th2细胞占比、血清IL-4水平、血清IL-6水平均明显高于对照组(t值分别为31.012、13.649、17.644,P<0.05);Th1细胞占比、Th1/Th2比值、血清IL-2水平、血清IFN-γ水平,以及FEF25%、FEF50%、FEF75%、FEF25%~FEF75%均明显低于对照组(t值分别为18.833、43.188、11.652、13.788、16.390、33.090、42.565、39.767,P<0.05)。CVA组外周血形成EETs的EOS百分比与Th2细胞占比、血清IL-4水平、血清IL-6水平均呈正相关(r值分别为0.532、0.421、0.395,P<0.05),与Th1细胞占比、Th1/Th2比值、血清IL-2水平、血清IFN-γ水平、FEF25%、FEF50%、FEF75%、FEF25%~FEF75%均呈负相关(r值分别为-0.253、-0.605、-0.321、-0.385、-0.421、-0.377、-0.485、-0.568,P<0.05)。ROC曲线分析显示,外周血形成EETs的EOS百分比诊断CVA的曲线下面积(AUC)为0.760(95%CI:0.687~0.824),灵敏度为78.95%,特异度为77.61%。结论外周血形成EETs的EOS百分比增高与CVA患儿Th1/Th2比值失衡、Th2细胞因子过度释放及小气道损伤有关,其有望作为CVA的潜在标志物。

成人急性髓性白血病患者血清Th1/Th2型细胞因子、PCT、CRP检测及其临床意义

目的 检测成人急性髓性白血病患者血清辅助性T细胞1/T细胞2(Th1/Th2)型细胞因子、降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)水平并探讨其临床意义。方法 选取2021年1月至2023年12月曲靖市第一人民医院收治的98例成人急性髓性白血病感染患者为研究组,按照不同感染程度分为17例脓毒症组与81普通感染组;同期选取98例成人急性髓性白血病无感染患者为非感染组;同期选择98例门诊健康体检者作为对照组。比较研究组、非感染组及对照组的血清白介素-2、干扰素-γ、白介素-4、白介素-10、PCT、CRP水平,比较脓毒症组与普通感染组患者的血清白介素-2、干扰素-γ、白介素-4、白介素-10、PCT、CRP水平,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析以上指标对成人急性髓性白血病感染的诊断价值。结果 研究组患者的血清白介素-2、干扰素-γ、PCT、CRP水平分别为(30.27±3.02) pg/mL、(280.16±31.59) pg/mL、(2.57±0.52) ng/mL、(89.42±10.36) mg/L,依次高于非感染组的(13.29±1.42) pg/mL、(229.47±23.15) pg/mL、(0.43±0.06) ng/mL、(13.28±1.54) mg/L和对照组的(6.09±1.26) pg/mL、(150.29±16.58) pg/mL、(0.21±0.03) ng/mL、(7.04±1.40) mg/L,差异均有统计学意义(P<0.05);研究组患者的血清白介素-4、白介素-10分别为(32.39±3.75) pg/m L、(2.96±0.45) pg/m L,依次低于非感染组的(51.03±7.28) pg/m L、(4.21±0.72) pg/m L和对照组的(78.29±10.45) pg/m L、(6.50±0.51) pg/m L,差异均有统计学意义(P<0.05);脓毒症组患者的血清白介素-2、干扰素-γ、PCT、CRP水平分别为(45.93±8.15) pg/m L、(340.17±40.21) pg/m L、(6.95±1.28) ng/m L、(134.73±12.81) mg/L,明显高于普通感染组的(26.98±2.57) pg/mL、(267.57±29.78) pg/mL、(1.65±0.36) ng/mL、(79.91±9.85) mg/L,差异均有统计学意义(P<0.05);脓毒症组患者的血清白介素-4、白介素-10水平分别为(18.87±1.65) pg/mL、(1.29±0.31) pg/mL,明显低于普通感染组的(35.88±4.19) pg/mL、(3.31±0.48) pg/mL,差异均有统计学意义(P<0.05);ROC曲线分析结果显示,白介素-2、干扰素-γ、白介素-4、白介素-10、PCT、CRP单独及联合检测对成人急性髓性白血病感染诊断的曲线下面积(AUC)分别为0.817、0.789、0.798、0.827、0.786、0.766、0.962,联合检测的AUC大于各指标单独检测。结论 成人急性白血病感染患者Th1细胞因子、PCT及CRP水平明显上升,Th2细胞因子水平明显下降,临床通过检测血清Th1/Th2细胞因子、PCT、CRP水平能够辅助成人急性髓性白血病感染的早期诊断,值得推广。

辅助性T细胞1/辅助性T细胞2标志性细胞因子与晚期肺腺癌化疗近远期疗效的关联性分析

目的分析辅助性T细胞(TH)1/TH2标志性细胞因子与晚期肺腺癌化疗近远期疗效的关联性。方法选取2021年1月至2023年12月江苏省徐州市中医院收治的82例晚期肺腺癌患者为研究对象,均给予培美曲塞+顺铂或卡铂治疗,21 d为1个周期,连续治疗3个周期。比较不同近期临床疗效者化疗前及化疗3个周期后血清γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-10变化及不良反应发生情况,并记录化疗后2年生存与死亡者化疗3个周期后血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10差异。结果82例晚期肺腺癌患者均完成3个周期的化疗,其中完全缓解(CR)1例,部分缓解(PR)34例,疾病稳定(SD)28例,疾病进展(PD)19例,晚期肺腺癌患者化疗3个周期后血清IFN-γ、IL-2均高于本组化疗前,血清IL-4、IL-10均低于本组化疗前,差异有统计学意义(P<0.05);CR+PR患者化疗后血清IFN-γ、IL-2高于SD+PD者,差异有统计学意义(P<0.05),血清IL-4、IL-10低于SD+PD者,差异有统计学意义(P<0.05)。CR+PR患者与SD+PD患者的化疗期间不良反应总发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。42例获得随访终点的晚期肺腺癌患者中死亡8例(19.05%),生存34例(80.95%),化疗后2年死亡者化疗3个周期血清IFN-γ、IL-2低于生存者,差异有统计学意义(P<0.05),血清IL-4、IL-10高于生存者,差异有统计学意义(P<0.05)。结论TH1/TH2平衡不仅与晚期肺腺癌患者化疗近期疗效有关,也与患者远期预后生存情况有关。

类风湿关节炎患者辅助性T2细胞的激活现象

目的 探讨辅助性T细胞 (Th) 2在类风湿关节炎 (RA)发病中的作用。方法 采用流式细胞术分析RA患者外周血淋巴细胞表面分化抗原 (CD) ,同时用酶免疫法检测血浆白细胞介素 (IL) 4、IL 6水平的变化。结果 与对照组相比 ,RA患者CD2 5 + (t=3.115 ,P <0 .0 1)和CD19+ (t=2 .5 6 1,P <0 .0 5 )细胞水平升高 ,其差异有显著意义 ;CD8+ /CD2 8-细胞减少 (t =2 .90 1,P <0 .0 1) ,其差异有非常显著意义 ;CD3+ 和CD4+ 细胞水平与对照组比较 ,差异无显著意义 (P >0 .0 5 ) ;IL 4(t =2 .42 1,P <0 .0 5 )和IL 6 (t=3.15 6 ,P <0 .0 1)增高 ,差异有非常显著意义。结论 类风湿性关节炎患者体内Th2细胞过度激活是其细胞免疫调节紊乱的重要表现。

Th1/Th2细胞因子检测在肺癌早期感染预测中的价值

目的:探讨辅助性T细胞(Th)1/Th2细胞因子[白细胞介素(IL)–2、γ干扰素(IFN–γ)、IL–4、IL–10]在肺癌患者早期感染预测中的价值。方法:选取福建医科大学附属南平第一医院2021年5月至2023年5月肿瘤科住院部收治的152例肺癌患者,将其纳入肺癌组,另选取同期76例健康体检人员作为对照组,经流式细胞术检测所有受检者外周血Th1/Th2亚群细胞因子谱(IL–2、IFN–γ、IL–4、IL–10)水平,肺癌组根据是否并发感染性疾病分为2个亚组,即肺癌感染组(82例)和肺癌非感染组(70例),观察并比较肺癌组与对照组、肺癌感染组与非感染组Th1/Th2细胞因子水平。结果:与对照组相比,肺癌组患者治疗前血清IL–2、IFN–γ水平更低,IL–4、IL–10水平更高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与肺癌非感染组患者相比,肺癌感染组患者血清IL–2、IFN–γ水平均更低,IL–4和IL–10水平均更高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:肺癌患者存在Th1/Th2细胞因子免疫反应状态紊乱,表现为血清IL–2、IFN–γ水平下降,IL–4、IL–10水平上升,并发感染性疾病时,IL–2和IFN–γ水平下降更明显,IL–4、IL–10水平升高明显,证明Th1/Th2细胞因子在肺癌早期感染中具有参考价值。

α_(1A)-肾上腺素能受体与增强型绿色荧光蛋白标记的活化T细胞核因子2稳定共表达细胞的构建

目的建立α_(1A)-肾上腺素能受体(α_(1A)-AR)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的活化T细胞核因子2(NFAT2)稳定共表达细胞。方法①将pcDNA3.1-α_(1A)-AR-3×FLAG重组质粒转染至U2OS-EGFPNFAT2细胞,经潮霉素B(Hygro-B)200 mg·L^(-1)压力筛选后加入α_(1A)-AR激动剂去甲肾上腺素(NE,10μmol·L^(-1))孵育30 min,通过高内涵筛选系统检测细胞核内绿色荧光强度,验证EGFP-NFAT2核转位,筛选得到稳定表达α_(1A)-AR的U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞。②采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western印迹法检测该细胞和对照细胞U2OS-EGFP-NFAT2中α_(1A)-AR mRNA和蛋白的表达水平。③将U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞接种于96孔板,分别加入NE(10^(-8)~10^(-5) mol·L^(-1))或α2-AR激动剂右美托咪定(DMED,10^^(-8.8)~10^(-5) mol·L^(-1))孵育30 min,通过高内涵筛选系统检测EGFP-NFAT2核转位。④将U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞分为溶剂对照组、α1-AR拮抗剂萘派地尔(1μmol·L^(-1))组、NE(1μmol·L^(-1))组、萘派地尔+NE(各1μmol·L^(-1)共孵育)组、α2-AR拮抗剂阿替美唑(0.1μmol·L^(-1))组、DMED(0.1μmol·L^(-1))组、阿替美唑+DMED(各0.1μmol·L^(-1)共孵育)组和萘派地尔+DMED(萘派地尔1μmol·L^(-1)与DMED 0.1μmol·L^(-1)共孵育)组,药物孵育时间均为30 min,通过高内涵筛选系统检测EGFP-NFAT2核转位,验证该细胞α_(1A)-AR功能的特异性。结果①Hygro-B压力筛选得到58株U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞,NE 10μmol·L^(-1)孵育后,其中50号细胞核内绿色荧光强度最强,故选定其为稳定共表达α_(1A)-AR和EGFPNFAT2的U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞。②Western印迹法结果显示,U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞可明显表达α_(1A)-AR蛋白,而对照细胞U2OS-EGFP-NFAT2中未见α_(1A)-AR蛋白表达。RT-qPCR结果显示,该细胞在传代5~20代内α_(1A)-AR mRNA均稳定表达,其表达水平为对照细胞的500~800倍。③NE或DMED使U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞中EGFP-NFAT2核转位明显增加,半数有效浓度(EC50)分别为5.94×10^(-7)和6.15×10^(-8) mol·L^(-1)。④与溶剂对照组和萘派地尔组比较,NE组U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞EGFP-NFAT2核转位明显增强(P<0.01),而萘派地尔+NE组EGFP-NFAT2核转位较NE组明显减弱(P<0.01)。与溶剂对照组和阿替美唑组比较,DMED组EGFP-NFAT2核转位明显增强(P<0.01),阿替美唑+DMED组EGFP-NFAT2核转位与DMED组比较无明显差别,而萘派地尔+DMED组EGFP-NFAT2核转位较DMED组明显减弱(P<0.01)。结论成功构建稳定共表达α_(1A)-AR和EGFP-NFAT2的U2OS-EGFPNFAT2-α_(1A)-AR细胞,可用于靶向α_(1A)-AR化合物筛选和受体分子机制研究。

骨形态构建蛋白2型受体下调单核细胞趋化蛋白1/CC类趋化因子受体2通路对哮喘小鼠气道炎症和Th1/Th2平衡的影响

目的探究骨形态构建蛋白2型受体(BMPR2)对小鼠哮喘模型气道炎症和Th1/Th2平衡的影响及其机制。方法于2021年9月至2022年11月选用24只C57BL/6小鼠尾静脉注射BMPR2腺病毒,随后卵清蛋白(OVA)致敏和激发建立哮喘小鼠模型;采用随机数字表法分为对照组(生理盐水替代OVA造模)、OVA模型组(OVA诱导小鼠哮喘模型)、OVA+载体(Vector)组(空载慢病毒处理的OVA哮喘模型小鼠)、OVA+BMPR2组(BMPR2过表达慢病毒处理的OVA哮喘模型小鼠),每组6只。收集支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织。免疫组织化学检测肺组织BMPR2表达水平;苏木精-伊红染色观察肺组织病理学改变;瑞氏染色后计数BALF中各类炎症细胞数目;酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒检测BALF中白细胞介素(IL)-4,IL-5和IL-13炎症因子水平;蛋白质印迹法检测肺组织和气道上皮细胞16HBE中BMPR2、单核细胞趋化蛋白-1(MCP1)及其受体CC类趋化因子受体2(CCR2)蛋白表达水平。免疫共沉淀实验检测BMPR2与MCP1相互作用。结果与对照组相比,OVA模型组肺组织BMPR2(0.36±0.05比1.04±0.04)显著降低(P<0.01);小鼠肺泡破坏程度严重,肺组织有大量的淋巴细胞浸润;BALF中炎症细胞总数[(93.25±9.32)×10^(4)个/毫升比(4.79±0.41)×10^(4)个/毫升,P<0.001]、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞均升高;Th1相关炎症因子γ干扰素(IFN-γ)水平降低,Th2相关炎症因子IL-4,IL-5和IL-13水平升高。过表达BMPR2可降低肺泡破坏程度和淋巴细胞浸润程度。与OVA+Vector组相比,OVA+BMPR2组BALF中炎症细胞总数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞均降低;ELISA结果表明,OVA+BMPR2组BALF中IFN-γ水平升高,IL-4,IL-5和IL-13水平降低,提示过表达BMPR2可上调Th1百分比,下调Th2细胞百分比。进一步研究表明,BMPR2过表达显著下调了MCP1及其受体CCR2的表达水平,且BMPR2与MCP1存在相互作用。结论BMPR2可通过下调MCP1/CCR2通路降低哮喘小鼠气道炎症,并调节Th1/Th2平衡。

靶向人表皮生长因子受体2嵌合抗原受体T(HER2-CAR-T)细胞毒性作用的体内外验证

目的 对靶向人表皮生长因子受体2嵌合抗原受体T(HER2-CAR-T)细胞进行毒理学评估,为其后期HER2-CAR-T细胞治疗的临床上评估提供安全性依据。方法 利用重组慢病毒载体制备HER2-CAR-T细胞,采用软琼脂集落形成实验,观察HER2-CAR-T细胞集落形成情况并对集落形成率进行统计分析;将HER2-CAR-T细胞悬液与兔红细胞悬液共孵,通过直接观察法以及酶标仪检测法评估红细胞溶解情况;对雄性新西兰兔耳缘静脉注射HER2-CAR-T细胞制剂,通过组织切片染色观察HER2-CAR-T细胞对动物血管的刺激作用;以pMD 2.G载体上的水泡性口炎病毒囊膜糖蛋白(VSV-G)基因为目标序列,利用荧光定量PCR进行慢病毒载体安全性的验证;取接受HER2-CAR-T细胞输注的小鼠心、肝、肺、肾,HE染色观察其病变情况。结果 成功制备了HER2-CAR-T细胞,这些细胞在体外不具备软琼脂集落形成能力,HER2-CAR-T细胞制剂对新西兰兔红细胞不产生溶血现象。新西兰兔耳缘静脉输注HER2-CAR-T细胞后未发现明显血管刺激反应,也未检测到VSV-G的特异性扩增,治疗组小鼠心、肝、肺、肾组织未见明显病变。结论 所制备的HER2-CAR-T细胞具有可靠安全性。

CircACAP2靶向miR-29a-3p/CCNT2轴对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响

目的:探讨CircACAP2靶向miR-29a-3p/细胞周期蛋白T2(CCNT2)轴对缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞损伤的影响。方法:将H9c2细胞分为Control组(正常培养)、si-NC组(转染si-NC)、Model组(建立H/R模型)、si-CircACAP2组(转染si-CircACAP2)、si-CircACAP2+inhibitor-NC组(si-CircACAP2和inhibitor-NC共转染)、si-CircACAP2+miR-29a-3p inhibitor组(si-CircACAP2和miR-29a-3p inhibitor共转染);实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测H9c2细胞中CircACAP2、miR-29a-3p的表达水平;四唑盐(MTT)法检测H9c2细胞活力;流式细胞仪检测H9c2细胞凋亡;单丹磺酰尸胺(MDC)染色法检测H9c2细胞自噬;乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒检测H9c2细胞上清中LDH、MDA、SOD水平,DCFH-DA荧光探针法检测细胞内活性氧(ROS)水平;蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞凋亡蛋白[B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)]、自噬相关蛋白(Beclin-1、P62)及CCNT2的表达;双荧光素酶报告检测CircACAP2对miR-29a-3p的靶向关系和miR-29a-3p对CCNT2的靶向关系。结果:与Control组比较,Model组H9c2细胞中CircACAP2表达、凋亡率、自噬囊泡数、LDH释放率、MDA、ROS水平、Bax、Beclin-1、CCNT2蛋白表达升高,miR-29a-3p表达、OD490值、SOD活性、PCNA、Bcl-2、P62蛋白表达降低(P<0.05);与Model组比较,si-CircACAP2组H9c2细胞中CircACAP2表达、凋亡率、自噬囊泡数、LDH释放率、MDA、ROS水平、Bax、Beclin-1、CCNT2蛋白表达降低,miR-29a-3p表达、OD490值、SOD活性、PCNA、Bcl-2、P62蛋白表达升高(P<0.05);与si-CircACAP2组比较,si-CircACAP2+miR-29a-3p inhibitor组H9c2细胞中CircACAP2表达差异无统计学意义(P>0.05),凋亡率、自噬囊泡数、LDH释放率、MDA、ROS水平、Bax、Beclin-1、CCNT2蛋白表达升高,miR-29a-3p表达、OD490值、SOD活性、PCNA、Bcl-2、P62蛋白表达降低(P<0.05);CircACAP2靶向调控miR-29a-3p的表达,miR-29a-3p靶向负调控CCNT2的表达。结论:敲低CircACAP2可能通过靶向miR-29a-3p来下调CCNT2表达,进而抑制H/R诱导的H9c2细胞凋亡、自噬能力及氧化应激,促进细胞增殖,发挥保护作用。

东紫苏精油对间充质干细胞C3H10T1/2成脂分化的影响及机制

为探讨东紫苏精油对小鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2成脂分化的作用及降脂机制,利用噻唑蓝[the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]法检测细胞成活率,以界定浓度的适宜范围;用油红O染色法对东紫苏精油作用后的细胞成脂分化作用进行分析;甘油磷酸氧化酶—过氧化物酶(glycerol phosphate oxidase-p-aminophenazone,GPO-PAP)法、胆固醇氧化酶、过氧化物酶和4-氨基安替比林苯酚(cholesterol oxidase,peroxidase and 4-aminoantipyrine phenol,COD-PAP)酶法检测东紫苏精油处理后细胞内甘油三酯、胆固醇含量的变化;荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和蛋白质印迹(western blot)分别检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxide proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding proteinsα,C/EBPα)、脂肪酸结合蛋白4(fatty acid-binding protein4,FABP4)mRNA和相关蛋白在成脂分化中的表达水平。结果表明:与空白对照组相比,高脂模型组的总胆固醇(total cholesterol,TC)和甘油三酯(triacylglyceride,TG)含量显著增加(P<0.05),小鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2中PPARγ、C/EBPα、FABP4 mRNA和蛋白表达明显增加。与高脂模型组相比,中剂量(50μg/mL)和高剂量(100μg/mL)精油组TC和TG含量明显下降,小鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2中PPARγ、C/EBPα、FABP4 mRNA和蛋白表达明显下降。试验结果表明,东紫苏精油可能通过调控PPARγ/C/EBPα/FABP4信号通路发挥对C3H10T1/2细胞成脂分化的抑制作用,达到减脂目的。

Synaptotagmin I和IV在LβT2细胞中的定位和shRNA基因干扰研究

目的:研究Sytnaptotagmin(Syt)I和IV在LβT2细胞中的定位和shRNA干扰技术对这两种蛋白在促性腺激素释放细胞(LβT2)细胞中蛋白表达量的影响。方法:运用全内反射荧光显微系统,通过在LβT2细胞中共表达各种细胞器的蛋白标记物和SytI、IV与荧光蛋白的融合蛋白,对SytI、IV进行细胞内定位。并运用shRNA干扰技术对SytI、IV在LβT2细胞中蛋白表达量进行了干扰。结果:发现了SytI、SytIV在LβT2细胞中和致密核心大囊泡(LDCV)都存在了一定的共存比例,而且shRNA技术对SytI和SytIV在LβT2细胞中的表达沉默产生了一定的效用。结论:SytI、SytIV在LβT2细胞中与致密核心大囊泡共存比例很大,shRNA干扰技术对SytI、SytIV的沉默具有高效性,为未来进一步对SytI、SytIV在LβT2细胞中的功能研究打下了基础。

生血合剂对慢性再生障碍性贫血患者T-bet/GATA-3、相关信号分子、细胞因子表达及Th_1/Th_2的影响

目的研究转录因子T-bet(T-box expressed in T cells)、GATA-3(GATA binding protein3)及相关信号通路在慢性再生障碍性贫血(chronic aplastic anemia,CAA)免疫发病中的作用,从辅助性T(helper T,Th)细胞失衡、转录因子及相关信号通路水平探讨生血合剂治疗CAA的免疫调控机制。方法 40例CAA患者均来自上海中医药大学附属岳阳医院,随机分为治疗组20例和对照组20例,选取体检健康者20名为正常组。治疗组患者辨证分为脾肾阳虚型和脾肾阴虚型,脾肾阳虚型患者服用生血合剂1号,脾肾阴虚型患者服用生血合剂2号,对照组服用环孢菌素A(CsA),采用实时荧光定量PCR(Realtime FQ-PCR)检测CAA患者治疗前后外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMNC)、T-bet、GATA-3及信号转导子及转录激活因子4(signal transducer and activator of transcription 4,STAT4)、STAT6 mRNA表达,采用流式细胞术、酶联免疫吸附法(ELISA)检测CAA患者治疗前后PBMNC Th_1、Th_2比例及PBMNC培养上清IFN-γ、IL-12、IL-4水平。结果 CAA患者PBMNC T-bet、STAT4 mRNA表达、T-bet/GATA-3比值、Th_1比例、Th_1/Th_2比值、PBMNC培养上清IFN-γ、IL-12表达均明显高于正常组(P<0.01),采用生血合剂或CsA治疗后,患者T-bet、STAT4表达、T-bet/GATA-3比值、Th_1比例、IFN-γ、IL-12表达均有所下降(P<0.01),但T-bet、STAT4、T-bet/GATA-3比值、Th_1比例、IFN-γ表达仍未达到正常水平,治疗组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),而GATA-3、STAT6 mRNA表达、Th_2比例、IL-4表达治疗前后与正常组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 IFN-γ/T-bet、IL-12/STAT4通路的异常活化,及Th_1/Th_2平衡向Th_1型偏移,在CAA免疫异常的发病过程中起关键的作用。生血合剂和CsA能通过下调IFN-γ/T-bet、IL-12/STAT4通路的异常活化,并纠正Th_1过度极化,从而减轻CAA异常亢进的细胞免疫,解除造血抑制。