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T4 DNA聚合酶在大肠杆菌中高效表达、纯化及部分生物学活性分析 被引量:2
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作者 付大伟 陈启蒙 +1 位作者 孙莹莹 徐伟 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2018年第16期214-220,共7页
T4 DNA聚合酶(T4 DNA polymerase,T4 DP)是基因工程等相关领域中不可缺少的工具酶。为获得大量高纯度并具有生物活性的可溶性T4 DP,通过从T4噬菌体基因组中克隆出T4 dp基因,将其克隆到pET-22b(+)质粒中构建重组表达载体pET-22b(+)-T4 dp... T4 DNA聚合酶(T4 DNA polymerase,T4 DP)是基因工程等相关领域中不可缺少的工具酶。为获得大量高纯度并具有生物活性的可溶性T4 DP,通过从T4噬菌体基因组中克隆出T4 dp基因,将其克隆到pET-22b(+)质粒中构建重组表达载体pET-22b(+)-T4 dp,经DNA测序检测成功后,转化到大肠杆菌Transetta(DE3)中进行自诱导表达,通过磁珠法高效准确检测T4 DP的可溶性表达情况,并对自诱导的温度和时间进行优化,确定最佳诱导条件为30℃诱导培养10 h,分别利用超声波法、超声波-溶菌酶法及化学裂解法对自诱导表达的重组菌体进行破碎,确定最佳破碎方法为化学裂解法,分别利用Ni Sepharose^(TM) 6 Fast Flow亲和层析柱和MagNi磁珠纯化重组菌体裂解后上清液中的T4 DP,MagNi磁珠能高效地纯化出高纯度的T4 DP,其质量浓度为3 073.960 μg/mL,成功获得了高纯度高质量浓度的可溶性T4 DP,并使其成功应用于克隆载体的构建,证明其具有较好的末端平滑化活性。 展开更多
关键词 t4dna聚合酶 自诱导 磁珠法 低背景克隆载体 末端平滑化
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Klenow大片段聚合酶及T_4DNA聚合酶在构建重组质粒中的应用 被引量:3
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作者 董玲 陈创夫 +2 位作者 韩亚杰 张金波 祝建波 《石河子大学学报(自然科学版)》 CAS 2006年第2期170-172,共3页
利用大肠杆菌Klenow大片段聚合酶5′→3′聚合酶活性和T4DNA聚合酶3′→5′外切酶特性构建植物高效表达载体pBLT35Svp4-ST。用pUC18-435S中的T35S启动子取代植物表达载体pBLG-VP4-ST中的双35S启动子,通过Klenow大片段的聚合酶活性对植... 利用大肠杆菌Klenow大片段聚合酶5′→3′聚合酶活性和T4DNA聚合酶3′→5′外切酶特性构建植物高效表达载体pBLT35Svp4-ST。用pUC18-435S中的T35S启动子取代植物表达载体pBLG-VP4-ST中的双35S启动子,通过Klenow大片段的聚合酶活性对植物表达载体pBLG-VP4-ST中的HindⅢ3′凹端补平,再利用T4DNA聚合酶外切酶活性将质粒pUC18-435S的四倍35S启动子即T35S中的SacⅠ3′凸端削平。在T4DNA连接酶作用下将一端为平端,另一端为BamHⅠ的粘性末端的四倍35S启动子定向连接到植物表达载体PBLG-VP4-ST中取代原有的双35S启动子,转化并筛选阳性克隆。结果经PCR和酶切鉴定证实,四倍35S启动子成功连接到植物表达载体PBLG-VP4-ST中。 展开更多
关键词 Klenow大片段聚合 t4dna聚合酶 构建 PBLG-VP4-St
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应用体外DNA同源重组技术构建pcDNA3.1-NGF和pcDNA3.1-TrkA
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作者 张严 龚爱华 +2 位作者 金洁 邵根宝 彭琬昕 《江苏大学学报(医学版)》 CAS 2011年第5期390-393,401,共5页
目的:利用体外DNA同源重组的方法分别构建含神经生长因子(NGF)和神经生长因子受体(TrkA)基因的真核表达载体。方法:在引物5'加上一段与载体克隆位点两端碱基序列相同的序列,PCR扩增目的基因NGF和TrkA,线性载体片段和目的基因片段经T... 目的:利用体外DNA同源重组的方法分别构建含神经生长因子(NGF)和神经生长因子受体(TrkA)基因的真核表达载体。方法:在引物5'加上一段与载体克隆位点两端碱基序列相同的序列,PCR扩增目的基因NGF和TrkA,线性载体片段和目的基因片段经T4 DNA聚合酶的外切产生互补的单链DNA,然后37℃退火实现体外同源重组,转化并鉴定;将重组质粒转染293A细胞,免疫印迹鉴定目的基因的表达情况。结果:成功构建真核载体pcDNA3.1-NGF和pcDNA3.1-TrkA,转染细胞后的表达产物相对分子质量分别是31×103和140×103。结论:与常规重组技术相比,体外DNA同源重组技术是一种高效的DNA重组方法,且不需考虑目的片段的限制性酶切位点。 展开更多
关键词 体外dna同源重组 tRKA 神经生长因子 t4dna聚合酶
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Construction of Vectors to Express Foreign Protein within Potato Starch Grains 被引量:11
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作者 李珺 马力通 姚新灵 《Agricultural Science & Technology》 CAS 2009年第4期72-74,共3页
[Objective] The aim is to study the construction of vectors expressing foreign protein in potato starch grains specifically, and provide some reference for solving industrialized core problem of high cost and low expr... [Objective] The aim is to study the construction of vectors expressing foreign protein in potato starch grains specifically, and provide some reference for solving industrialized core problem of high cost and low expression level of foreign protein. [Method] By using molecular biological techniques of RT-PCR and nested PCR, plant expression vector for the foreign protein locating in the potato starch grains was constructed. [ Result] Coding sequence ( GC20 ) of potato starch grains that was located and expressed by GBSSI promoter was cloned. Plant expression vector was screened out through connection, transformation and enzyme digestion identification. [ Conclusion] This result laid a foundation for further screening the foreign protein on the potato starch grains. 展开更多
关键词 Foreign protein Plant bioreactor GBSSI GC20 Starch grains
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PCR产物直接分子克隆的比较研究 被引量:16
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作者 王瑛 《生物工程进展》 CSCD 1996年第5期55-57,共3页
本文比较了PCR产物的三种分子克隆技术,实验证明其中T4DNA聚合酶切平和T-A互补法较凝胶电泳回收加Klenow酶切平法远为有效和简便。对这几种克隆技术的方法学还作了进一步的讨论。
关键词 分子克隆 聚合链反应 t4dna聚合酶 t-A互补
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