普通小麦-簇毛麦T6VS·6AL易位染色体的品质效应分析

[目的]了解小麦-簇毛麦T6VS·6AL易位染色体对衍生高代品系的品质效应,为山西中部麦区培育含抗白粉病基因Pm21的优质、高产小麦新品种提供科学依据。[方法]采用MPA傅里叶变换近红外光谱仪分析了70个含纯合6VS·6AL易位染色体的小麦高代品系及8个相应亲本的蛋白质含量、湿面筋含量和沉降值。[结果]绝大多数高代品系的蛋白质含量、湿面筋含量和沉降值低于双亲,说明T6VS·6AL易位染色体对上述3个品质性状有一定的负向效应。参试T6VS·6AL高代品系的蛋白质含量、湿面筋含量和沉降值在不同组合间表现趋势不一致,而且同一组合的不同品系之间存在着显著差别。[结论]在组合配置时要考虑亲本的影响,同时注重对品质性状的早代选择。

普通小麦-簇毛麦T6VS·6AL易位染色体对小麦品质的影响

为分析簇毛麦6VS导入小麦背景后对品质的影响,利用普通小麦-簇毛麦T6VS.6AL易位系和地方品种辉县红构建的一套小麦F8重组近交家系(RIL)群体,通过分子标记结合白粉病抗性鉴定,筛选出66个包含和94个不包含T6VS.6AL的纯合家系,并分别组成两个亚群体,于2005-2006年分别在江苏南京和河南郑州通过随机区组设计(各3个重复)进行14个品质性状差异比较。结果表明,3对高分子量麦谷蛋白基因在群体及其两个亚群体中均符合1∶1分离。方差分析发现,T6VS.6AL亚群体面粉平均吸水率、面团稳定时间、最大抗延阻力和50 mm处抗延阻力均显著高于非T6VS.6AL亚群体,揭示该易位系对这些性状表现正向效应;T6VS.6AL亚群体籽粒平均容重、面粉峰值黏度和面团弱化度显著低于非T6VS.6AL亚群体,揭示该易位系对这些性状具有负向效应,而T6VS.6AL亚群体面粉平均蛋白质含量、干面筋、湿面筋、出粉率、形成时间、拉伸面积和延伸度与非T6VS.6AL亚群体无显著差异,揭示该易位系对这些性状影响较小。

基于高代姊妹系组群研究小麦-簇毛麦染色体T6VS.6AL易位的遗传效应

为了解小麦-簇毛麦抗白粉病易位染色体T6VS.6AL的遗传效应以更好地将其用于小麦品种选育,对扬麦18原始区域试验种子衍生的抗白粉病姊妹系、感白粉病姊妹系组群进行主要农艺和品质性状的比较。结果表明:T6VS.6AL易位对小麦的千粒质量、株高和穗长有极显著正向效应,对每穗小穗数呈显著正向效应,对小穗密度呈极显著负向效应,对单株总粒数、每穗粒数、单株穗数、株系产量没有显著影响;T6VS.6AL易位总体上对小麦品质没有影响。综上所述,高代姊妹系组群是准确评价特定染色体区段遗传效应的宝贵材料,在利用T6VS.6AL易位系进行滚动回交育种时,建议选择中矮秆、综合丰产性和广适性好的品种作为最晚轮回亲本。

T6VS·6AL染色体易位与小麦籽粒HMW-GS和GMP积累的关系

从一套由92R137(普通小麦-簇毛麦T6VS·6AL染色体易位系)和辉县红(地方小麦品种)杂交及以单粒传方法构建的F8重组近交家系(RIL)群体中,筛选出4个HMW-GS亚基组合相同而蛋白质含量差异较大的代表性家系(含和不含染色体易位片段的家系各一组),采用SDS-PAGE电泳和切胶比色的亚基定量方法,研究了不同家系小麦籽粒灌浆期间HMW-GS和GMP含量动态。结果表明,小麦籽粒各亚基在花后13d均已形成,但不同亚基起始形成时间不同;各亚基含量随灌浆进程呈上升趋势,花后23d到成熟期为快速积累期。染色体易位片段对籽粒HMW-GS和GMP含量与积累量无显著作用,而籽粒HMW-GS含量以蛋白含量高的家系高于对应的低蛋白家系。

小麦-簇毛麦6VS/6AL易位染色体对小麦农艺性状的影响

利用3类试验材料,即由不同生态类型的推广品种与小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系经过杂交回交选育的高代品系(种),3份涉及6VS/6AL的高代分离品系以及5个以小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系作杂交亲本的F2群体,对含有与不含有6VS/6AL易位染色体材料的产量、株高、穗长、穗粒数、穗粒重和千粒重等农艺性状进行方差分析。结果表明,6VS/6AL易位染色体对后代的小穗数、穗粒数、穗粒重和产量等农艺性状没有表现出明显的影响,对穗长和千粒重表现出一定的正向效应。多数6VS/6AL衍生品系的株高与亲本相比有所增加,但在同一组合的不同品系之间表现出一定的差异,在育种过程中通过选择可改变增高趋势。6VS/6AL易位系对白粉病免疫,并且遗传稳定,对小麦的抗病育种是很有潜力的抗源亲本。

t(6;11)染色体易位肾细胞癌中Alpha基因片段的克隆及启动子活性分析

目的：构建包含不同Alpha基因片段的重组报告质粒和Alpha1-TFEB融合基因表达质粒,并评价Alpha基因启动子活性。方法：利用软件对Alpha基因进行启动子预测;采用PCR技术扩增出5种不同长度的Alpha基因片段和正常TFEB基因启动子序列pTFEB,构建含Alpha基因片段和pTFEB的重组报告质粒;采用脂质体转染法将其分别转染至人胚肾293T细胞;通过荧光素酶活性检测确定Alpha基因的启动子活性。同时构建含Alpha1-TFEB融合基因表达质粒,转染293T细胞后,采用Western blot法检测转染前后TFEB蛋白的表达水平。结果：成功构建含不同Alpha基因片段和pTFEB的重组报告质粒。与pGL3-Basic质粒转染组进行比较,Alpha1、Alpha2、Alpha3、Alpha4、Alpha5质粒转染组的荧光素酶活性显著增高（P〈0.01）;与正常TFEB基因启动子进行比较,Alpha1、Alpha2、Alpha5的荧光素酶活性明显增高（P〈0.01）;与pGL3-Enhancer质粒转染组进行比较,pGL3-Enhanc-er-Alpha1-TFEB表达质粒组TFEB蛋白的表达明显升高。结论：t（6;11）染色体易位肾细胞癌中Alpha基因具有启动子活性,可促进TFEB表达,Alpha5片段最强活性区域位于643~693位碱基序列。

利用染色体C-分带和双色荧光原位杂交技术鉴定普通小麦-黑麦-簇毛麦双重易位系1RS·1BL,6VS·6AL

为改进小麦－黑麦 １ＲＳ· １ＢＬ易位系的抗病性，丰富栽培小麦品种的遗传多样性，本文通过１ＲＳ·１ＢＬ与６ＶＳ·６ＡＬ易位系杂交，在后代中利用染色体ＣＷ带技术从杂种Ｆ２中鉴定出小麦－黑麦－簇毛麦双重易位纯合体 １ＲＳ· １ＢＬ，６ＶＳ· ６ＡＬ（２ｎ＝ ４２），ＰＭＣ ＭＩ染色体平均构型为１９．１４ ＋１．８６ ，表明该易位系具有良好的细胞学稳定性；利用生物素和地高辛分别标记的黑麦和簇毛麦基因组ＤＮＡ为探针进行双色荧光原位杂交，在ＲＴＣ和ＰＭＣ中均清晰地观察到呈黄绿色的黑麦染色质和呈红色的簇毛麦染色质，小麦染色质呈蓝色，进一步证实了Ｃ－分带结果。该易位系育性正常，并具有良好的农艺性状和白粉病抗性，是同时利用１ＲＳ·１ＢＬ和６ＶＳ·６ＡＬ易位染色体进行小麦品种改良和遗传研究的有用种质。

用克隆池PCR法筛选小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL基因组TAC文库获得抗病基因候选克隆

用根据抗病基因保守区设计的一对简并性引物 ,从小麦 簇毛麦易位系 6VS 6ALcDNA中PCR扩增获得一个具有抗病基因核苷酸结合位点 (Nucleotidebindingsite,NBS)结构特点的DNA片段克隆N7。从小麦 簇毛麦易位系6VS 6AL基因组TAC(Transformation competentartificialchromosome,TAC)文库的 2 2块 96孔板提取所有 2 112个克隆池(每个池含约 10 0 0个克隆 )的质粒 ,再根据N7的核苷酸序列设计一对特异引物 ,用克隆池PCR(pooledPCR)法经分级筛选从文库中获得一个阳性克隆。以N7为探针 ,通过Southern杂交证实了该TAC克隆为真正含有抗病候选基因的克隆。

小麦穗部性状和株高的QTL定位及T6VS·6AL易位效应分析

为了发掘新的穗部性状和株高QTL,利用扬麦17与扬麦18杂交后代206个单株组成的F2群体,构建了一个由141个SSR标记组成的全长1005.1cM的遗传图谱。该图谱包括26个连锁群,覆盖15条染色体,标记间平均距离为7.03cM。结合F2和F2:3群体的表型数据,对穗部性状和株高进行QTL分析,利用复合区间作图法检测出15个QTL,分布在2B、2D、4B、5A、5B和7A染色体上,其中4个QTL能够同时在两个世代被检测到,表型变异解释率为1.93%~20.78%,穗长QTLQSl-YY-2D、QSl-YY-5A和株高QTLQPh-YY-4B的贡献率超过10%。根据6VS特异性标记鉴定和表型调查结果,推测扬麦18的6VS上携带有增加穗长和穗粒数的基因,且为部分显性。2B染色体上总小穗数和5B染色体上穗粒数、穗基部结实粒数的QTL增效等位基因及2D、4B染色体上降低株高的QTL增效等位基因均来自扬麦18,表明该品种可作为具有高产潜力的小麦育种材料加以利用。

绵麦37及其衍生小麦品种(系)的6VS/6AL易位染色体结构演变

绵麦37是四川小麦育种的骨干亲本,含6VS/6AL易位染色体,高抗白粉病。为了明确6VS/6AL在其衍生品种中的传递情况,本研究利用寡核苷酸探针和ND-FISH技术对内麦8号、绵麦37的衍生品种(系)和部分相关亲本共17份材料进行了分析。结果表明,内麦8号、绵麦37及其9个衍生品种(系)都含有1对6VS/6AL易位染色体,其中内麦8号、绵麦37、绵麦51、绵麦285、绵麦1416、绵麦1419和绵麦1618的6AL长臂上带有寡核苷酸探针Oligo-713的信号,而其余4个衍生品种(系)的6VS/6AL染色体无该探针信号,说明绵麦37衍生品种(系)中的6VS/6AL染色体出现了新型结构变异。根据系谱和其他亲本的ND-FISH分析结果可以推测,这种结构变异是由6VS/6AL易位染色体与小麦6A染色体在长臂上发生重组交换引起的。

普通小麦-簇毛麦易位系T4VS·6AL的选育

在小麦背景中离果山羊草3C染色体具有优先传递的作用。当离果山羊草3C染色体处于单体状态时会导致后代不含有杀配子染色体的配子中产生包括缺失和易位等染色体结构变异。簇毛麦4V染色体携有抗小麦眼斑病和全蚀病基因。为进一步利用簇毛麦4V染色体上的有益基因,利用染色体C-分带和基因组原位杂交分析,从普通小麦-簇毛麦4V染色体二体异附加系(DA4V)与普通小麦农林26-离果山羊草3C染色体二体异附加系(DA3C)杂种后代中选育出小麦-簇毛麦纯合易位系T4VS·6AL。该易位系为杀配子染色体诱发形成的非补偿型易位;易位系T4VS·6AL高抗梭条花叶病,是小麦抗病育种的新种质。

MeRIP-qPCR技术检测RNA m^(6)A甲基化修饰对t(8;21)AML细胞中KDM4B基因表达的调控作用

目的:通过MeRIP联合逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)技术,证明WTAP介导的RNA m^(6)A修饰对伴t(8;21)急性髓系白血病(AML)细胞中KDM4B基因的直接调控作用。方法:采用靶向WTAP或KDM4B基因的短发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体沉默t(8;21)AML细胞系Kasumi-1和SKNO-1中WTAP或KDM4B基因表达,以转染随机打乱序列(scramble)的shRNA的细胞为对照。用超纯RNA提取试剂盒(DNaseⅠ)提取细胞RNA,Magna MeRIP^(TM)m^(6)A Kit试剂盒富集甲基化修饰片段,并通过RT-qPCR检测m^(6)A甲基化修饰的RNA区域;采用蛋白免疫印迹实验(Western blot)和逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)技术检测细胞中WTAP、KDM4B蛋白和mRNA的表达水平。采用克隆形成实验检测细胞体外克隆形成能力。结果:沉默Kasumi-1细胞中WTAP的表达后,m^(6)A甲基化修饰在KDM4B mRNA 3’UTR的富集程度显著下降(P<0.01),沉默Kasumi-1和SKNO-1细胞中WTAP的表达可显著抑制KDM4B蛋白(P<0.001)和mRNA表达水平(Kasumi-1:P<0.001;SKNO-1:P<0.01)、细胞体外克隆形成能力下降(Kasumi-1:P<0.001;SKNO-1:P<0.01)。结论:t(8;21)AML细胞系中,WTAP通过调控KDM4B基因mRNA 3’UTR的m^(6)A修饰调控KDM4B的表达,沉默KDM4B表达可以抑制t(8;21)AML细胞增殖。

普通小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系抗病性在不同小麦遗传背景中的传递

小麦条锈病和小麦白粉病是中国小麦的两大病害 ,由南京农业大学细胞遗传研究所培育的小麦 簇毛麦 6VS/ 6AL易位系高抗白粉病 ,并对中国当前新优势条锈菌生理小种表现高抗。用 6VS/ 6AL易位系与中国不同小麦生产区的栽培品种宁春 4号、扬麦 5号、扬麦 15 8、申 32 10 9、豫麦 13、豫麦 18等进行杂交 ,对其杂种后代进行田间抗条锈病和抗白粉病鉴定。从各杂交组合中均选出对白粉病和条锈病高抗的单株和株系 ,其抗病性在小麦不同遗传背景中可以正常表达。对从F3 ～F8代中选出的抗病材料进行根尖染色体C 分带和分子原位杂交鉴定 ,在所鉴定的高抗单株和株系中均含有一对或一条 6VS/ 6AL易位染色体。

小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系叶片cDNA文库构建及鉴定

用表达型质粒载体pSPORT 1构建了经白粉菌 (Erysiphegraminis)诱导 48h和未经诱导的小麦 簇毛麦 6VS/ 6AL易位系(Triticumaestivum Haynaldiavillosatranslocationline)叶片cDNA文库各一个。文库宿主菌为E .coliDH10B。非诱导文库包含约 5 0万个重组cDNA克隆 ,平均插入片段为 1 2 5kb ,主要分布在 40 0bp～ 2 2kb。诱导文库包含约 30万个重组cDNA克隆 ,平均插入片段 1 2kb。用克隆的病程相关基因 (pathogenesisrelatedgene) 小麦类甜蛋白基因pWIR作探针 ,进行杂交筛库 ,杂交信号明显 。

普通小麦-簇毛麦6VS／6AL易位系cyclophilin基因的克隆与序列分析

利用RT-PCR的方法从普通小麦-簇毛麦6VS／6AL易位系克隆到1个cyp基因，命名为Ta-Hv-cyp。该基因全长为599bp，编码1条171个氨基酸残基的多肽，具有保守的功能位点W128和胞质型CyP蛋白特有的插入序列KSGKPLH48-54。BLAST分析表明，推导的Ta-Hv-CyP蛋白分别与小麦、水稻、玉米、拟南芥的胞质型CyP具有98％，88％，85％和80％的氨基酸序列一致性。构建的进化树显示，推导的Ta-Hv-CyP蛋白与单子叶植物胞质型CyPs的亲缘关系较近。

小麦—簇毛麦6VS/6AL易位材料幼胚一步成苗培养技术集成

基因型差异是影响小麦幼胚一步成苗培养的主要因素。比较了小麦—簇毛麦易位材料与扬麦5号和中国春的一步成苗培养的污染率、成苗率、再生植株生根培养效率等主要技术指标,建立了适用于小麦—簇毛麦易位材料幼胚的—步成苗培养的有效技术体系,为培养纯合的普通小麦—簇毛麦6VS/6AL,小片段易位体系提供了技术支持。

不同簇毛麦6VS染色体臂的白粉病抗性特异功能标记的开发及应用

小麦6VS·6DL易位系Pm97033和6VS·6AL易位系92R137中的6VS染色体臂来自不同的簇毛麦种质,均表现良好的白粉病抗性,本研究利用分子标记对这2个易位系所包含抗病基因的异同进行了鉴定。利用与Pm21抗白粉病相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Stpk-V基因(GenBank登录号为HQ864471.1)的基因组和cDNA序列为基础,在包含至少1个内含子的2个编码区设计引物,从Pm97033中扩增获得特异的多态性片段。为进一步提高特异性和扩增的稳定性,对特异扩增片段测序并重新设计引物,扩增筛选获得2个引物对,其中PK-F1/PK-R可专一扩增6VS·6DL易位系Pm97033及其抗病亲本,而PK-F2/PK-R可同时特异扩增2个不同来源的簇毛麦6VS染色体,但二者间的特异片段具有多态性。利用这2对引物,对系谱中包含6V(6D)和6VS·6AL、抗白粉病的小麦品系CB037进行检测,发现仅出现与6VS·6AL易位系相同的簇毛麦扩增片段,不存在簇毛麦No.1026(Pm97033的6VS供体)的扩增片段。基因组原位杂交结果表明,CB037仅含1对小麦-簇毛麦的易位染色体,用已报道的分子标记检测证明易位涉及的小麦染色体为6A,与本研究开发的分子标记检测结果相吻合,表明CB037携带的白粉病抗性基因来自6VS·6AL易位系92R137,其白粉病抗性可能与Pm97033具有不同的遗传基础。

含Pm21基因的次级易位创制及鉴定

小麦-簇毛麦6VS.6AL易位携带抗白粉病基因Pm21,对我国小麦抗白粉病育种做出了重要贡献。本文对162份四川小麦品种(系)的55KSNP芯片数据分析表明,25份含6VS.6AL易位染色体,占15.4%。重组位置和单倍型分析表明,这些材料的6VS.6AL均为着丝点易位、具有单一来源。根据系谱分析, 92R178为最原始的供体材料。利用由ph1b诱导6VS/6AS部分同源重组形成的,含Pm21基因的初级易位6VS-6AS.6AL和6AS-6VS.6AL为亲本,创制了1个含Pm21基因、6VS片段大幅减小的6AS-6VS-6AS.6AL次级易位。根据中国春参考基因组,该次级易位的2个重组位点,分别位于6A染色体53.1~53.8 Mb和90.7~92.2 Mb之间,易位片段大小在36.9~39.1 Mb之间。分子细胞学鉴定表明,ph1b诱导外源易位的同时,小麦自身的内源染色体也发生了大量易位,这影响易位系的遗传稳定和育种利用。为了解决这个问题,建议将ph1b基因突变系以杂合的形式进行长期保存。同时,在利用ph1b诱导小麦-外源易位的过程中,尽量减少ph1b纯合状态下的繁殖世代,以减少小麦内源染色体易位。育种利用时,应尽快消除小麦内源易位。