东方田鼠肺脏T7噬菌体展示cDNA文库的构建

目的构建东方田鼠肺脏T7噬菌体展示cDNA文库,为筛选东方田鼠抗血吸虫感染抗性相关基因奠定基础。方法用TRIzol试剂提取东方田鼠肺脏总RNA,分离纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoR Ⅰ/Hind Ⅲ接头并用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ消化,使其两端分别带EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ黏性末端。用Mini Column纯化,收集300bp以上的双链cDNA片段,再连接于带有EcoR和Hind末端的T7 Select 10-3b载体,经体外包装后,以BLT5403为受体菌构建T7噬菌体展示cDNA文库。结果经测定,库容量为1.5×106pfu,扩增后文库滴度为1.1×1012pfu/ml。对从原始文库中随机挑取的100个噬菌斑进行PCR鉴定,重组率为91%,阳性克隆片段长度分布在200-1500bp,其中有90%的插入片段〉300bp。结论成功构建了东方田鼠肺脏T7噬菌体展示cDNA文库。

微小隐孢子虫T7噬菌体展示文库的构建

目的为筛选微小隐孢子虫保护性抗原基因,构建了微小隐孢子虫T7噬菌体展示文库。方法用Trizol试剂提取微小隐孢子虫总RNA,分离纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头,用EcoRⅠ和HindⅢ消化接头,使形成两端分别带有EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端的双链cDNA。经Mini Column纯化,收集400bp以上的双链cDNA片段,将其连接于带有EcoRⅠ和HindⅢ末端的T7Select 10-3b载体,经体外包装后,以BLT5403为受体菌构建T7噬菌体展示文库。结果经测定,库容量为1.2×107pfu/mL,重组率为96.7%,扩增后文库滴度为2.4×1010pfu/mL。对随机挑取的100个噬菌斑进行PCR鉴定,92%的插入片段大于400bp。结论成功构建了微小隐孢子虫T7噬菌体展示文库。

新孢子虫cDNAT7噬菌体展示文库的构建及筛选

为筛选犬新孢子虫相关抗原,本研究利用T7噬菌体展示技术构建犬新孢子虫cDNA文库,并利用阳性血清筛选新型犬新孢子虫抗原蛋白。所构建的新孢子虫cDNA文库的原始文库重组克隆数为6×106pfu,扩增后文库滴度为3×1010pfu/mL。分别提取犬新孢子虫免疫小鼠血清和感染小鼠血清中的IgG,并利用纯化的IgG对构建的新孢子虫cDNA文库进行筛选。经过3轮筛选,共鉴定出14个不同的犬新孢子虫基因插入片段。经过分析,有7个基因编码的是功能未知蛋白,其它为蛋白质合成相关蛋白、核苷酸代谢相关蛋白、核糖体蛋白、微线体蛋白、棒状体蛋白和致密颗粒蛋白。对这些蛋白的进一步研究将有助于开发新孢子虫病的诊断试剂和疫苗。

家蚕中肠cDNA T7噬菌体展示文库的构建和免疫相关基因的淘选

中肠是昆虫重要的免疫防御器官之一。为探究家蚕中肠的分子免疫机制,尤其是针对不同病原体的模式识别分子或结合蛋白,以家蚕5龄第3天幼虫中肠为材料,构建家蚕中肠cDNA T7噬菌体展示文库,并分别以几丁质和脂多糖为配体,通过不同方法进行文库的生物淘选。结果共获得10个基因片段,其中在以脂多糖为配体的淘选中获得了β-1,3葡聚糖识别蛋白4,该分子是已知的模式识别受体。另外还获得了多个免疫相关候选基因,如分别编码几丁质结合蛋白、翻译控制的肿瘤蛋白、氨肽酶N、脂肪酰辅酶A结合蛋白等的几个基因。研究结果为深入开展家蚕中肠免疫功能的研究提供了重要线索。

结核分枝杆菌T7噬菌体展示基因组DNA文库的构建与鉴定

目的利用T7噬菌体作为载体,构建结核分枝杆菌的基因组DNA文库。方法提取MTB的基因组DNA,用EcoR I和Hind III进行双酶切,以对基因组DNA进行片段化,并在其末端加上定向的EcoR I和Hind III黏性末端,用DNA片段纯化分离柱除去小于200bp的片段和多余接头。将DNA片段与T7 10-3b噬菌体连接,经包装蛋白进行包装后转入BLT5403宿主菌以构建T7噬菌体展示基因组DNA文库,并检测文库的滴度和随机性。结果成功提取到较高质量的MTB基因组DNA;构建的T7噬菌体展示基因组DNA文库的滴度约为6×106 pfu/cm3;用PCR检测结果表明,在随机挑取的16个噬菌斑中,其重组率为100%,且插入片段都介于250~2 000bp左右。结论成功构建了MTB T7噬菌体展示基因组DNA文库,为从基因组范围筛选MTB的优势抗原奠定了前期实验基础。

PK15细胞cDNA T7噬菌体展示文库的构建及鉴定

【目的】构建PK15细胞cDNAT7噬菌体展示文库，为研究猪源病毒与宿主细胞的相互作用奠定基础。【方法】分离纯化PK15细胞mRNA，先后合成第一链和第二链cDNA，经平末端修饰后，定向导入EcoR Ⅰ和HindⅢ接头，再由EcoRⅠ和HindⅢ双酶切消化，与噬菌体载体臂相连，然后用噬菌体包装抽提物进行体外包装，形成初级cDNAT7噬菌体展示文库，并通过滴度测定和PCR鉴定文库质量。【结果】经噬斑试验鉴定，初级文库滴度为2．0×10^5PFU／mL，扩增后滴度达6．0×10^10PFU／mL。PCR鉴定结果显示，文库的重组率为95．83％，且插入片段主要分布于500-2000bp，其中500～750bp的占21．73％，750～100bp的占21．73％，1000-2000bp的占39．13％。随机挑选20个克隆进行测序，发现均为猪源序列。【结论】构建的PK15细胞cDNAT7噬菌体展示文库具备较高库容量和重组率，质量良好，符合后续文库筛选的要求，可用于研究猪源病毒蛋白与PK15细胞的相互作用。

T7噬菌体展示文库筛选肺癌早期检测分子标志群

目的从肺癌T7噬菌体展示文库筛选出能用于肺癌早期检测的分子标志群。方法亲和筛选肺癌T7噬菌体展示文库,对纯化后的富集肺癌相关肽的文库进一步行两轮ELISA检测,PCR扩增阳性噬菌体插入片段,测序后经过NCBI上的BLAST序列比对。结果筛选出13个有意义噬菌体,测序结果显示1个为未知功能的新基因,其余的均已确定与癌症相关;且13个基因中包含有三组相同的基因。结论从T7噬菌体构建的肺癌cDNA文库中筛选出的一组阳性噬菌体表达的抗原,可能是潜在的肺癌诊断分子标志群。

犊牛口腔黏膜上皮细胞T7噬菌体展示文库的构建

试验旨在筛选水泡性口炎病毒的受体,构建犊牛口腔黏膜上皮细胞T7噬菌体展示文库。通过用Trizol试剂提取犊牛口腔黏膜上皮细胞总RNA,然后分离和纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头,然后用EcoRⅠ和HindⅢ酶消化双链cDNA末端接头,使双链cDNA 2端含有EcoRⅠ和HindⅢ黏性末端。所有处理后的双链cDNA,经Mini Column纯化,收集400bp以上的双链cDNA片段,将其连接带有EcoRⅠ和HindⅢ末端的T7Select 10-3b载体,经体外包装后,以BLT5403为受体菌构建T7噬菌体展示文库。经测定未扩增文库的滴度为1.3×107PFU/mL,重组率为95.8%,扩增后文库滴度为2.6×1010 PFU/mL。随机挑取100个噬菌斑进行PCR鉴定,95%的插入片段大于400bp。结果表明成功构建了犊牛口腔黏膜上皮细胞T7噬菌体展示文库。

T7噬菌体展示人肺癌cDNA文库筛选丹参-人参组分复方靶点研究

目的通过噬菌体展示技术筛选丹参-人参组分复方(丹参总酚酸、人参总皂苷、人参多糖)的作用靶点。方法经过T7噬菌体展示人肺癌c DNA文库的4轮淘选,获得阳性噬菌体克隆,随机挑选10个克隆进行DNA提取和测序。基因序列用Ex PASy网站的Translate tool查找开放阅读框(ORF)。选取代表性多肽用生物膜干涉技术检测亲和力。结果 4轮淘选后阳性噬菌体克隆得到高度富集,10个样品中7个有相同的DNA序列,长度为471 bp(序列1),另外3个完全一致,长度为58 bp(序列2)。序列1得到4个ORFs,序列2未进行分析。丹参-人参组分复方和多肽His-MNTGRFGKTTSSPALTLGNFQKPL亲和力最高,K_D=4.57×10^(-8)mol/L,人参多糖、丹参总酚酸和多肽亲和力分别为K_D=7.23×10^(-8)mol/L、K_D=7.66×10^(-8)mol/L,人参总皂苷与多肽没有典型的结合和解离效应。结论本研究获得了与丹参-人参组分复方高亲和力多肽,为丹参-人参组分复方肺癌靶向治疗研究提供依据。

凡纳滨对虾T7噬菌体cDNA展示文库的构建

以来源于多种组织的mRNA为模板,构建了一个凡纳滨对虾混合组织的T7噬菌体c DNA展示文库。结果表明:噬菌体文库容量大,达9.3×10~7pfu;文库重组率高,为97%;大于250 bp的片段占70%以上;利用液体扩增法对文库进行扩增,扩增后文库的滴度为2.1×10^(12)pfu/m L。

应用改进的多聚组氨酸标签T7表达载体构建肺癌cDNA文库

应用噬菌体C端展示系统构建的cDNA文库缺乏开放阅读框筛选机制,文库中多数噬菌体克隆展示框外非天然短肽,给后期蛋白质的筛选带来了不便.为实现噬菌体的ORF筛选功能,利用PCR技术对已有载体T7Select10-3b进行改造,在MCS处外源cDNA插入位点的3'端引入6聚组氨酸筛选标签,经包装后挑取成功表达的单克隆构建肺癌cDNA文库.经镍柱亲和层析后,收集文库中表达组氨酸的克隆,利用化学发光免疫试验进行筛选效果鉴定.结果显示,改造的新型载体可成功表达组氨酸标签,以此构建的肺癌cDNA文库经筛选后,含ORF插入的克隆由筛前的6%提高至70%,本研究为提高cDNA文库的质量提供了一种简便可行的方法.

T7 cDNA噬菌体展示文库筛选法氏囊活性肽BPP-Ⅱ结合蛋白及鉴定

法氏囊活性五肽BPP-Ⅱ是近期发现的具有免疫调节功能的活性多肽。为了研究法氏囊活性肽对B细胞的作用机制,采用鸡B淋巴细胞cDNA T7噬菌体文库筛选法氏囊五肽BPP-Ⅱ与鸡B相互作用的受体蛋白。三轮筛选后,富集的噬菌体滴度达1010pfu以上。富集噬菌体克隆的序列分析结果表明,与BPP-Ⅱ相互作用的鸡B淋巴细胞cDNA文库中序列与核受体辅阻遏物2同源。结果说明,法氏囊活性肽BPP-Ⅱ可能参与多种细胞过程,从而产生多种生物学效应。

人尿道上皮细胞T7噬菌体展示cDNA文库的构建与鉴定

[目的]构建人尿道上皮细胞(SV-HUC-1)T7噬菌体展示c DNA文库,为研究人尿道上皮细胞与生殖道感染病原体的相互作用奠定基础。[方法]用Trizol试剂提取SV-HUC-1细胞总RNA,分离纯化出mRNA,经反转录合成得到其双链c DNA,在双链c DNA末端加上定向的EcoRⅠ/HindⅢ黏性末端,然后收集并纯化200bp以上的双链c DNA片段,连接于T7噬菌体载体,经体外包装后转入BLT5403宿主菌,T7噬菌体展示c DNA文库构建成功。[结果]将文库扩增后,用噬斑试验检测其库容,结果为1.2×106pfu/cm3。用PCR鉴定随机挑取的噬菌斑,计算其重组率达93.75%,且插入片段都大于200bp。[结论]成功构建了SV-HUC-1细胞T7噬菌体展示c DNA文库,为下一步研究泌尿生殖道感染病原体与人尿道上皮细胞的相互作用奠定了前期实验基础。