利用T7核酸外切酶和硫代磷酸化修饰引物克隆长片段基因的研究

目的采用不依赖连接反应的克隆法,利用T7核酸外切酶和硫代磷酸化修饰引物克隆Notch2长片段基因。方法将难以扩增的Notch2 c DNA的编码序列(7416 bp)人为分成3段,引物设计时对此3个片段和载体骨架的引物进行碱基硫代磷酸化修饰,用这些引物扩增Notch2的3个片段和载体骨架。然后用T7核酸外切酶分别处理PCR产物,产生4个具有3'互补突出末端的片段,并将此4个末端突出的片段退火复性,完成Notch2基因克隆。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示Notch2 3个片段和载体骨架的PCR产物大小与预期大小相符,经退火复性获得的克隆通过PCR、酶切和测序进行克隆鉴定,确定Notch2编码序列已经插入到pc DNA3.0-3*Flag载体中。结论利用T7核酸外切酶和引物的碱基磷酸化修饰进行的不依赖连接反应的克隆方法能够用于长片段基因的克隆。

基于Au NPs@g-C_(3)N_(4)及目标物循环扩增构建miRNA光电化学生物传感器

为实现对microRNA-141(miRNA-141)的准确灵敏检测,该文利用纳米金修饰的氮化碳(Au NPs@g-C_(3)N_(4))作为基底修饰性材料结合T7核酸外切酶参与的目标物循环扩增过程构建高灵敏的光电化学(PEC)生物传感器。首先将具有优异光稳定性和光电特性的Au NPs@g-C_(3)N_(4)修饰在电极表面。通过Au-N键固定S1-S2后,孵育封闭剂己硫醇(HT)。当加入miRNA-141和T7核酸外切酶之后,目标物循环扩增过程被启动,导致电极表面暴露出大量单链S1。最终,通过DNA杂交引入S3-SiO_(2)复合材料,从而产生空间位阻效应,阻断外部电子供应和光捕获途径,进而导致PEC信号显著猝灭。由此构建了准确、灵敏检测miRNA的光电化学生物传感器。结果表明,光电流与miRNA浓度的对数呈现良好的线性关系,其线性范围为1 fmol/L~1 nmol/L,检出限为0.3 fmol/L。