比较T7E1和Surveyor核酸内切酶对于点突变的检测效率

目的:比较T7E1和Surveyor核酸内切酶对于CRISPR-Cas9引起的点突变的错配剪切活性。方法:利用野生型和点突变的基因组DNA为模板,PCR扩增出突变位置的基因片段,用不同比例的野生型和点突变的PCR产物进行DNA杂交,分别用T7E1和Surveyor核酸内切酶对杂交后的产物进行切割,琼脂糖凝胶电泳分析结果。结果:当5%点突变DNA与95%野生型DNA杂交时,T7E1核酸内切酶剪切杂交产物的比例为9.5%,Surveyor核酸内切酶为3.2%;当点突变DNA与野生型DNA等比例杂交时,T7E1核酸内切酶剪切杂交产物的比例为45.6%,Surveyor核酸内切酶为26.4%;且T7E1和Surveyor核酸内切酶均能检测5%的突变DNA。结论:T7E1核酸内切酶检测点突变的效率高于Surveyor。

CRISPR/Cas9基因编辑系统中两种gRNA活性检测方法比较

目的:比较CRISPR/Cas9系统中gRNA活性检测的两种方法,即利用Surveyor/T7E1核酸酶检测方法或利用Cas9蛋白的体外检测方法。方法:一方面构建表达Cas9和特异gRNA的质粒,转染NIH3T3细胞,然后提取DNA,利用T7E1核酸内切酶检测gRNA介导Cas9切割靶DNA并产生indel突变的效率;另一方面,设计引物并利用PCR扩增出gRNA的DNA模板片段,通过体外转录获得gRNA,利用Cas9蛋白及gRNA进行体外反应检测切割效率。结果:利用Cas9蛋白体外酶切可以检测到较高的gRNA活性,然而通过T7E1核酸酶方法检测gRNA在细胞中活性整体偏低,且在不同基因之间差异较大。结论:细胞Surveyor/T7E1法与Cas9蛋白体外酶切法检测到的gRNA活性不完全一致,体外活性检测法不能替代。

腺相关病毒介导的体内睾丸组织基因特异性敲除系统的建立

目的建立一套可用于体内睾丸组织特异性敲除基因的系统。方法利用同源重组技术将CRISPR/Cas9系统中sgRNA功能元件插入到AAV表达载体,将人源Wee1 2#sgRNA构建入改造的AAV-sgRNA(新版)载体中进行病毒包装,并感染稳定表达Cas9的HeLa-spCas9细胞验证该载体的基因敲除效率。筛选睾丸组织特异表达基因Sycp3的sgRNA靶点,构建入AAV-sgRNA(新版)载体中,进行病毒包装,利用显微注射技术将病毒注射入小鼠睾丸组织曲细精管内,通过T7E1分析体内细胞的基因敲除效果。结果构建成功的AAV-sgRNA载体能够进行病毒包装并在体外细胞水平上对人源Wee1进行基因编辑,与慢病毒介导的CRISPR/Cas9系统中的载体编辑效率相比无明显差异。同时,该系统能在体内水平对Sycp3进行基因编辑。结论成功建立一套可用于在体内睾丸组织中进行特异性敲除目标基因的系统,为生殖体内功能研究提供一个新的思路和方法。

Cas9-sgRNA共质粒系统提高在AAVS1位点的打靶效率

目的:为进一步提高CRISPR/Cas9系统的打靶效率,比较共质粒或双质粒表达Cas9内切酶和小向导RNA(sg RNA)的不同载体设计对其打靶效率的影响。方法:将针对AAVS1位点的2个sg RNA序列分别插入表达Cas9的质粒p Sp Cas9上,再将其构建为Cas9-sg RNA二合一的共质粒以及独立表达sg RNA和Cas9的双质粒系统;质粒转染293T细胞后,用T7E1酶切方法检测打靶效率。结果:不经过变性退火的PCR片段也能直接进行T7E1酶切;Cas9-sg RNA共质粒系统的打靶效率显著高于双质粒系统。结论:T7E1酶切方法可去除变性退火步骤,简化了传统的检测方法。采用Cas9-sg RNA共表达的载体设计可显著提高打靶效率。

甲基化酶DNMT3B基因敲除的CHO-K1细胞系构建

构建敲除DNMT3B基因的细胞系,为重组蛋白药物生产使用的高效表达系统提供DNMT3B基因缺失的稳定细胞株.采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建敲除DNMT3B基因的质粒,并利用脂质体转染CHO-K1细胞进行基因编辑、T7E1核酸内酶切及筛选DNMT3B基因敲除细胞,以及软琼脂法获得单克隆.结果表明,通过对获得的单细胞克隆进行测序比对,确定DNMT3B基因第4个外显子处被编辑产生移码突变.最终获得DNMT3B基因特异位点删除的CHO细胞单克隆.

三种CRISPR/Cas9基因敲除变异检测方法的比较分析

比较三种常用的CRISPR/Cas9基因敲除检测变异方法,从准确性、耗时、成本和应用限制等方面进行评估。采用T7核酸内切酶I、限制性内切酶和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法分别对利用CRISPR/Cas9方法敲除的fibinb和ngs基因的50尾斑马鱼(Danio rerio)突变纯合个体和突变杂合个体进行检测,用野生型个体作对照;同时用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对CRISPR/Cas9方法敲除的ogn和ddb1基因的突变杂合个体进行了检测。结果表明:三种方法均能够区分突变杂合个体,其中T7核酸内切酶I检测法耗时最短,但该方法不能用于鉴定突变纯合个体;限制性内切酶检测法能够用于鉴定纯合个体,但需要有特异性的识别位点;非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法能够区分纯合和杂合个体,对序列无依赖性,能够检测出序列中存在的所有变异。成本上,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法最经济;限制性内切酶的价格存在较大的差异,因此检测成本依赖于酶的价格。三种检测方法各有优缺点,在应用实践中可根据试验需要选择合适的方法。

利用CRISPR系统介导人类mir-505基因位点的编辑

目的:通过针对人源mir-505基因,设计不同sgRNA,从而利用CRIPSR系统对mir-505基因位点进行编辑,并探讨CRISPR系统对靶点的剪切效率的影响因素。方法:针对人源mir-505基因设计两条具有不同GC%的sgRNA,随后分别将其构建入41824-sgRNA表达载体和42230-Cas9蛋白/sgRNA共表达载体,并将表达载体利用脂质体转染法转染入人类细胞,通过T7E1assay检测不同CRISPR系统对靶点剪切效率的影响。结果:对靶点的剪切与Cas9蛋白和sgRNA的剂量成正比;当sgRNA与Cas9蛋白共传递时,也能够明显提高靶点的剪切效率;而较低的sgRNA的GC%会降低其对靶点的剪切效率。结论:本研究利用CRISPR系统靶向人源细胞的mir-505基因,使得mir-505基因发生突变。CRISPR系统对靶点的剪切效率和sgRNA和Cas9蛋白的剂量、sgRNA是否和Cas9蛋白共传递以及sgRNA的GC%有关。