云南野生稻抗稻瘟病Pi-ta基因的检测及分析

以16个不同来源的云南野生稻作为供试材料,用抗稻瘟病Pi-ta基因特异引物(KG2/KG4)进行PCR扩增,并对PCR产物进行克隆、测序及分析。结果表明,16个野生稻中7个品种持有抗稻瘟病Pi-ta基因,其中,来自云南景洪的紫秆普通野生稻中Pi-ta基因的编码区与原始型的抗稻瘟病Pi-ta基因的DNA序列完全相同。可见,云南可能是抗稻瘟病基因Pi-ta的起源地之一。

云南景洪直立型普通野生稻抗稻瘟病Pi-ta^＋等位基因的克隆与分析

用PCR法从景洪直立紫杆普通野生稻中克隆了抗稻瘟病基因Pi-ta+的4672bp序列,该序列包含完整的编码框、内含子和终止密码子下游的331bp。所克隆的直立型紫杆普通野生稻Pi-ta基因序列的编码区与已报道的日本栽培稻社糯(Yashiro-mochi)和元江普通野生稻相应序列间的同源性分别为99.86%和98.78%。与社糯的Pi-ta基因相比,其编码区有4个核苷酸的差异并导致3个氨基酸残基的改变,而内含子区域有6个核苷酸差异。对该序列进一步分析发现,其推导的氨基酸残基的918位为丙氨酸,属于稀有的抗稻瘟病的Pi-ta+等位基因。景洪直立型普通野生稻Pi-ta+基因因其编码序列和推导的氨基酸序列与社糯有所不同,推测其抗病能力大小和抗菌谱可能与社糯的Pi-ta基因不同。直立型普通野生稻中Pi-ta+等位基因的克隆为进一步利用该基因改良栽培稻抗病能力提供了前期物质基础。

应用BSP联合TA克隆测序检测胰腺癌中RASSF1A基因启动子区异常甲基化

目的:检测Ras相关区域家族1A(Ras association domain family 1A,RASSF1A)在胰腺癌细胞株中的甲基化和表达状态,探讨其启动子异常甲基化在胰腺癌发病过程中的作用。方法:采用重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite genomic sequencing PCR,BSP)联合TA克隆测序检测胰腺癌细胞株PANC-1及胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织中RASSF1A启动子区CpG岛的甲基化状态,以甲基化酶抑制剂5-aza-2-deoxycitydine(5-aza-dC)处理PANC-1,观察处理前后甲基化率变化情况,逆转录PCR观察RASSF1A的mRNA表达情况。结果:在PANC-1细胞中RASSF1A启动子的甲基化率平均为100.00%,在正常胰腺、癌旁及癌组织中平均分别为1.79%、93.75%和100.00%,与正常胰腺组织相比,胰腺癌旁及癌组织的RASSF1A启动子甲基化率明显增高(P<0.01),而癌旁及癌组织之间无明显差异(P>0.05)。在PANC-1细胞、胰腺癌组织及癌旁组织中RASSF1A基因无表达,在正常胰腺组织中RASSF1A基因呈阳性表达;PANC-1细胞经5-aza-dC处理后,RASSF1A的甲基化率下降(88.89%,P<0.05),mRNA表达无变化。结论:胰腺癌细胞株PANC-1及癌组织、癌旁组织RASSF1A基因表达与启动子区甲基化状态有关,启动子区的高甲基化导致PANC-1中RASSF1A基因的表达沉默。该基因异常甲基化有望成为胰腺癌的早期诊断指标和治疗靶点。

TA载体pEASY-T1 Simple在基因克隆中的新应用

在基因克隆操作中,由于常用克隆载体多克隆位点的酶切位点数目有限,造成一些DNA片段的克隆、连接受限。为解决这一问题,本文利用pEASY-T1 S imp le载体无酶切位点的特点,通过TA克隆的方法引入多个单一酶切位点,并对所构建的克隆载体进行了验证。最后证明,这种方法可高效构建含有不同多克隆位点的载体,克服了对常用克隆载体的依赖,大大提高了基因操作的灵活性和有效性。

利用TA克隆载体构建pET15b-SOD1重组质粒

目的利用pGEM-TEasyvector构建pET15b-SOD1重组质粒。方法以pBluescriptIISK-SOD1质粒为模板,应用pfuDNA聚合酶,聚合酶链反应法(PCR)扩增SOD1cDNA。将扩增的SOD1cDNA与三磷酸脱氧腺苷(dATP)反应,然后通过TaqDNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在SOD1cDNA的3’末端加“A”并纯化,然后将纯化后的SOD1cDNA与pGEM-TEasyvector直接连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α,蓝白筛选,挑选白色克隆扩增、鉴定,重组的质粒命名为pGEM-TEasy-SOD1。pGEM-TEasy-SOD1和pET15b分别用XhoⅠ、BamHⅠ双酶切,采用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收所需片断,前者回收470bp的SOD1cDNA片段,后者回收线性化的pET15b片段,将两者连接后转化大肠杆菌DH5α,抽提后的重组体质粒命名为pET15b-SOD1,然后对pET15b-SOD1进行酶切和核苷酸序列测序鉴定。结果重组质粒pET15b-SOD1经测序分析证实克隆入pET15b-SOD1的人SOD1cDNA与GeneBank“AB087266”登录的人SOD1cDNA序列一致,从而成功构建了pET15b-SOD1重组质粒。结论pET15b-SOD1重组质粒的构建为细胞穿透肽介导的SOD1转导提供了一对照载体。

TA克隆的应用研究

目的 :探讨用于PCR扩增产物快速高效的克隆技术。方法 :为制备T载体 ,用SmaI消化质粒 pUC18成纯末端 ,纯化后与TaqDNA聚合酶及dTTP ,75℃反应 2h ,构建成加上T尾的线性 pUC18载体。将由质粒 pBR32 2 HPV16中PCR扩增获得早期蛋白E6的基因扩增产物 ,根据TA克隆策略克隆至pUC18 T载体中 ,经PCR、限制性酶切分析鉴定重组子 ,并对TA克隆连接条件做了探讨。 结果 :获得重组质粒 pUC18 E6。 结论 :TA克隆采用低温延时连接 ,阳性克隆率高 ,是高效。

采用TOPO-TA克隆法建立多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶基因家族cDNA文库

目的:通过实验方法建立多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶基因家族cDNA文库,欲以此为基础对人体不同肿瘤细胞中的该基因家族进行表达谱分析。方法:主要为PCR和TOPO-TA克隆技术。结果:通过电泳图谱初步证实了这一家族的不同成员均已得到有效的扩增,并获得了相应的片段库。结论:多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶基因家族cDNA被成功扩增,并建立了该基因家族的cDNA文库。

构建TA载体快速克隆PCR产物

目的 为了快速克隆ＰＣＲ产物，本实验构建了简单、方便的 ＴＡ载体。方法 ＰＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（－）经 ＥｃｏＲ Ｖ酶切形成平端切口，在ＴａｑＥ的催化下加一个ｄＴＭＰ形成３’端带有Ｔ的粘端载体，在Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用下，将ＰＣＲ产物互补连接于ＴＡ载体上，重组质粒转化细菌，碱裂解法提取重组质粒ＤＮＡ，酶切及电泳鉴定。结果ＴＡ载体成功地克隆了ＰＣＲ产物。结论构建的ＴＡ载体简单、方便，可以克隆任何ＰＣＲ产物。

大鼠金属蛋白酶组织抑制物-1反义基因片段TA克隆载体的构建

目的 构建含大鼠金属蛋白酶组织抑制物 1(tissueinhibitorofmetalloproteinase 1,TIMP 1)反义基因片段TA克隆载体 ,为进一步研究TIMP 1在肾组织纤维化中的作用奠定基础。方法 本实验利用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR) ,从提取的大鼠肾组织总RNA中特异地扩增含 313bp的TIMP 1cDNA片段 ,并将其克隆到TA载体。结果 用限制性内切酶鉴定 313bp的TIMP 1cDNA片段插入方向 ,测序结果证实扩增片段为目的片段。结论 成功地构建了含大鼠TIMP

中国人常见GJB2基因突变片段TA克隆载体构建

目的应用TA克隆技术构建含中国人常见GJB2基因突变片段的载体，为构建突变绿色荧光蛋白融合载体提供基础。方法首先利用定点诱变法在体外构建235delC．299-300delAT和176del16bp绿色荧光蛋白非融合载体，以此为模板利用PCR扩增突变基因片段，然后将PCR扩增产物克隆到TA载体上，用限制性内切酶法和测序法鉴定重组质粒序列正确性。结果用限制性内切酶法和测序方法证实扩增片段为目的片段。结论成功地构建了235delC、299-300delAT和176del16bp突变基因片段TA克隆载体，为构建突变绿色荧光蛋白融合载体、进一步研究突变致聋机制奠定了基础。

限制性酶切片段的TA法直接克隆与测序(英文)

报道了一种粘性末端的限制性酶切片段的直接克隆和测序的方法.对限制性酶切片段的粘性末端先用T4DNA聚合酶处理,变为平末端,然后用TaqTMDNA聚合酶在其3′末端加上A腺苷,即可利用T/A克隆载体进行直接克隆测序.利用这种简单而快速的方法,对2个RFLP探针Psr680的限制性酶切片段 1.65kb和0.65kb 进行了测序,表明这种方法可以替代利用相应载体进行相应酶切等处理的粘性末端连接克隆测序的方法.

小麦Ta-UBX1基因克隆、表达及生物信息学分析

为深入研究小麦U-BOX基因的功能,以周麦22和周麦24为材料,利用RT-PCR技术克隆小麦的Ta-UBX1基因,对其序列结构、基因表达和进化特性进行分析。结果表明,小麦Ta-UBX1基因全长2 059 bp,编码553个氨基酸,在其序列的N端和C端分别具有UBA_like保守域和UBX结构域,属于泛素途径中的典型U-BOX蛋白,并且与其他禾本科植物同源的U-BOX蛋白具有高度的序列相似性;该基因在小麦叶片、小花、幼穗、根、种子中均有表达,但以小花和幼穗中的表达量较高,叶片中表达量较低;在花药发育的四分体期和单核早期表达量最高,单核后期到三核期表达量逐步降低,推测该基因表达可能与小麦花发育,尤其花药发育密切相关。本研究可为探究该基因的功能奠定分子基础。

HLA-DR_α基因片段TA克隆载体的构建

目的 应用TA克隆技术构建含HLA-DRα基因的载体,作为实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测 HLA-DRα基因的标准模板。方法 利用RT-FCR法,从提取的外周血单核细胞总RNA中特异地扩增含635bp的HLA- DRαcDNA片段,并将其克隆到TA载体。结果 用限制性内切酶法和测序方法证实扩增片段为目的片段。结论 成功地构建了 HLA-DRα基因片段TA克隆载体。为实时荧光定量RT-PCR法检测HLA-DRαmRNA表达提供标准模板。

改进重叠延伸PCR克隆tau基因6种同工异构体

采用一种改进的重叠延伸PCR技术,通过2次PCR的方法,对人tau基因进行剪切和拼接,实现了tau基因的6种同工异构体的克隆;然后将6种tau基因克隆到真核载体pcDNA4上,通过western blot在蛋白水平验证了tau蛋白的表达.结果表明,这种改进重叠延伸PCR方法能够对基因进行多个位置的剪切和连接,由于该法在基因重组过程中无需利用限制性内切酶,因此具有很大的灵活性和简便性.

产物可直接进行“TA”克隆的高保真PCR法

[目的]介绍一种PCR产物直接进行“TA”克隆的高保真PCR法,减少高保真PCR产物“TA”克隆的中间步骤。[方法]Trizol法提取人肝癌细胞SMMC-7721总RNA,并将mRNA反转录成cDNA。以cDNA为模板,联合不同特性的Taq DNA聚合酶扩增PKC基因的蛋白编码区。PCR产物经纯化后进行“TA”克隆、细菌转化、筛选培养、质粒抽提、酶切鉴定和测序鉴定等。[结果]高保真DNA聚合酶扩增的PCR产物未发现DNA突变,但不能直接进行“TA”克隆。Taq DNA聚合酶扩增的产物可直接进行“TA”克隆,但其内部存在多个突变位点,保真性明显不足。联合使用高保真DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶(双酶联用)扩增的PCR产物可直接进行“TA”克隆,且DNA测序未发现突变。[结论]双酶联用PCR可以获得高保真PCR产物,并直接进行“TA”克隆。

人胸苷激酶基因cDNA克隆

目的 克隆人胸苷激酶基因cDNA。方法采用逆转录PCR方法扩增胸苷激酶cDNA ,用十二烷基氟波酯 (TPA)刺激人外周血细胞的mRNA为模板 ;扩增的PCR产物经TA克隆重组和内切酶鉴定 ,以及DNA序列分析确定克隆基因的序列。结果经逆转录PCR扩增出一个 70 0bp左右的DNA片段 ,TA克隆出现 1 6个阳性克隆 ,选择其中的一个克隆 (TKTA8)进行DNA序列分析 ,序列分析结果表明TKTA8克隆重组的序列是人胸苷激酶的cDNA序列。结论从外周血细胞中得到了hTK完整的开放读码框架。

使用与Gateway技术兼容的T载体获得入门克隆

与Gateway技术兼容的农杆菌双元载体系统已开始应用于植物功能基因组的研究 ,但应用这些载体系统的一个瓶颈问题 ,是如何简单、经济和高效地将PCR产物或其他来源的目的DNA片段构建到入门载体上获得入门克隆 .为此 ,将传统的TA克隆技术与Gateway重组克隆技术进行整合 ,构建了与Gateway技术兼容的两种TA克隆载体 ,用于在克隆PCR产物或其他来源的目的DNA片段的同时获得入门克隆 .利用兼容Gateway技术的TA克隆载体有效地解决了上述瓶颈问题 .

pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒的构建及PEP-1-CAT融合蛋白的表达与纯化

目的构建pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒,并表达、纯化得到融合蛋白PEP-1-CAT,为防治与氧化应激有关的疾病奠定基础。方法设计并合成两端分别带SalI和BglII酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长cDNA。将扩增的CATcDNA与dATP反应,利用TaqDNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CATcDNA的3'末端加“A”并纯化,然后应用TA克隆策略将纯化后的CATcDNA插入至中间载体pGEM-TEasyVector中得到pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核苷酸,两端分别引入NdeI和XhoI酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经SalI-BglII和XhoI-BamHI双酶切,利用同尾酶(SalI与XhoI,BglII与BamHI)能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CATcDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。将鉴定正确的pET15b-PEP-1-CAT重组质粒转化BL21(DE3),用IPTG诱导目的蛋白表达。然后利用重组蛋白N端的组氨酸“标签”(His-tag)对其进行金属螯合亲和层析纯化。结果测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CATcDNA序列一致。SDS-PAGE和Westernblot结果表明,pET15b-PEP-1-CAT在E.coli中获得可溶性高表达,经Ni2+-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的融合蛋白PEP-1-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性,活性值为77.15U/g。结论成功构建了原核表达载体pET15b-PEP-1-CAT,并经表达、纯化得到可以天然活性形式穿透细胞的重组过氧化氢酶蛋白,从而为防治心肌缺血再灌注损伤等与氧化应激有关的疾病奠定了基础。

PEP-1-SOD1融合蛋白的表达及纯化

目的构建原核表达载体pET15bPEP1SOD1,并进行PEP1SOD1融合蛋白表达和纯化。方法以pBluescriptIISKSOD1质粒为模板,PCR扩增SOD1cDNA。经酶切后,分别构建原核表达载体pET15bSOD1和pET15bPEP1SOD1,经测序证实构建成功后,分别转化E.coliBL21(DE3),表达SOD1和PEP1SOD1融合蛋白,并进行鉴定。结果SDSPAGE和Westernblot分析表明,分别在相对分子质量22000和26000处出现SOD1和PEP1SOD1目标表达条带,目的蛋白占菌体总蛋白的30%,两种表达蛋白以天然的、可溶性的形式存在。结论已成功地制备出SOD1和PEP1SOD1融合蛋白。

原核表达质粒pET15b-PEP-1-SOD1的构建

目的构建pET15b-PEP-1-SOD1原核表达质粒。方法通过设计含有特定酶切位点的引物,以含有全长人SOD1 cDNA的质粒(pBluescript II SK-SOD1)为模板,扩增出SOD1 cDNA,将SOD1 cDNA和人工合成的编码PEP-1的双链寡核苷酸克隆至pET15b原核表达载体上,进行酶切鉴定及测序分析。结果pET15b-PEP-1-SOD1重组质粒经酶切鉴定含有SOD1 cDNA和编码PEP-1的片段,测序分析证实分别与GeneBank“AB087266”登录的人SOD1 cDNA和合成的PEP-1编码序列完全一致。结论成功地构建了pET15b-PEP-1-SOD1重组质粒,为制备PEP-1-SOD1融合蛋白提供了表达载体。