柔嫩艾美耳球虫BJ株TA4基因的表达及电泳分析

球虫子孢子表面抗原TA4(25kD)是通过二硫键连接8和17kD 2条多肤形成的,在孢子化后期合成。E.tenella BJ株的TA4基因同国外株的同源性为99％。本试验进行了TA4基因的原核融合表达,并对表达蛋白的SDS-PAGE电泳特性进行探究。试验发现,以pGEX-KG为载体,用IPTG可诱导TA4基因在E.coli BL21(DE3)中的表达。SDS-PAGE表明,融合蛋白大小约43 kD,而非推测的51 kD,诱导6 h的蛋白表达量即可达到较高水平,表达量约为31％。采用抗GST抗体进行Western blotting,成功检测到了特异性条带。说明SDS-PAGE前的样品煮沸处理可使连接TA4 2条多肽的二硫键断裂,只有17 kD的多肽可与26 kD GST蛋白结合。样品采用反复冻融法处理,加入还原型谷胱苷肽后,采用GST凝胶回收柱Sepharose 4B纯化的融合蛋白主要为51 kD的单一条带,煮沸变性后电泳,则43 kD带含量增加。说明纯化过程可影响GST-TA4融合蛋白的特性。

鸡柔嫩艾美耳球虫ZJ株TA4基因的克隆及原核表达

本试验对E. tenella ZJ株的TA4基因进行了克隆和表达。根据已报道的柔嫩艾美尔球虫TA4基因序列设计引物,以孢子化卵囊总RNA为模板,用RT-PCR的方法扩增得到一特异片段,将扩增产物克隆至pMD18-T,转化DH5-α感受态,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列比较,核苷酸同源性为99.1%。然后将重组质粒和表达载体pGEX-4T2分别以EcoRⅠ、XhoⅠ酶切后构建重组表达载体pGEX-TA4,并将其转化入大肠杆菌BL21中,提取质粒经酶切和PCR鉴定正确后,用IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Westernblot检测显示,TA4基因在大肠杆菌中获得表达;融合蛋白的分子量约为43ku,以包涵体形式存在;诱导6h的蛋白表达量可达到35.9%,采用抗GST抗体进行Westernblot,成功检测到了该特异性条带。

柔嫩艾美耳球虫杨凌株TA4基因的克隆和原核表达

根据国外报道的序列设计1对引物,以纯化的柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)杨凌(YL)株孢子化卵囊的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出E.tenella YL株的TA4基因。序列分析表明,该序列全长741bp,开放阅读框(ORF)为651bp,共编码217个氨基酸,与E.tenella HT株、E.tenella BJ株和E.tenella ZJ株的TA4基因ORF序列同源性分别为99.8%、99.8%和99.27%。由此确定所获得的目的基因为E.tenella YL株TA4基因。利用生物信息学和分子生物学软件对TA4基因编码的蛋白进行结构预测,结果表明,该蛋白为一结构松散的球状蛋白。将TA4基因克隆到表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-TA4并在大肠杆菌BL21中进行表达,表达产物的SDS-PAGE分析结果表明,成功地表达了分子质量为41ku的融合蛋白。

柔嫩艾美耳球虫TA4抗原基因cDNA在乳酸乳球菌中的克隆与表达

用PCR技术特异扩增了柔嫩艾美耳球虫TA4抗原基因cDNA序列,克隆至质粒pMD18-T中,获得重组质粒pMD18-T-TA4,采用KpnⅠ/SacⅠ双酶切法及PCR确认正确后,将TA4基因cDNA目的片段亚克隆到乳酸乳球菌表达载体pMG36n中,电穿孔法转化乳酸乳球菌LM0230,获得重组质粒pMG36n-TA4,采用KpnⅠ/SacⅠ双酶切法及DNA测序证明cDNA序列完全正确。获得TA4乳酸乳球菌表达株,经SDS-PAGE电泳分析,结果表明表达产物与预期大小的TA4蛋白分子量一致。

毒害艾美耳球虫江苏分离株抗原基因NA4的克隆与序列分析

采用直肠接种毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)裂殖子方法对毒害艾美耳球虫卵囊进行纯化,用柔嫩艾美耳球虫子孢子表面抗原TA4基因特异性引物,以纯化E.necatrix孢子化卵囊总RNA为模板,RT-PCR方法克隆出了一段新基因序列。该基因全长747bp,共编码248个氨基酸,与国外Brothers等(1991)从E.necatrix孢子化卵囊表面得到的NA4基因同源性达99.7%,与柔嫩艾美耳球虫TA4(No.AJ586531.2)基因同源性达到91.4%,拥有与柔嫩艾美耳球虫TA4抗原基因相同序列的一段信号肽。从结果可得出,新克隆的基因为E.necatrix NA4基因。此基因已登录GenBank,登录号为EU523548。