INRA717-1B4杂交杨TAC基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建及编辑效率检测

TAC(tiller angle control)基因作为IGT [G?L(A/T)IGT]保守家族的一员,与植物体内各类激素相互作用,共同参与分枝角度的调控。为探究TAC基因的分子结构功能及其调节功能,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,以INRA717-1B4杂交杨为试验材料构建pDE-CAS9-NPTⅡ表达载体,通过农杆菌介导法侵染叶片进行遗传转化获得阳性植株,并通过测序检测基因编辑效率。最终获得基因编辑转基因株系12株,其中实现基因突变的2株,编辑效率为16.7%。本试验为CRISPR/Cas9系统在杨树TAC基因功能的验证提供了借鉴,为进一步在木本植物中的应用研究提供了技术支持。

柯乐猪TAC3R基因SNP位点鉴定及其对繁殖性状的影响

【目的】探究速激肽受体3基因(TAC3R)单核苷酸多态性(SNP)位点与柯乐猪繁殖性能的关联性,筛选出与繁殖性状相关的遗传标记,为加速柯乐猪的品种改良提供技术支撑。【方法】选取195头2胎以上的健康经产柯乐猪为研究对象,运用Sanger直接测序法鉴定TAC3R基因SNP位点,利用SHEsisPlus计算各SNP位点的群体遗传参数,并以SPSS 22.0中的一般线性模型(GLM)分析SNP位点基因型和双倍型对柯乐猪5个繁殖指标的遗传效应。【结果】在柯乐猪TAC3R基因上共检测到5个SNPs位点:g.117686266T>C、g.117686381A>G、g.117686384A>G、g.117688503T>C和g.117688518T>C。g.117686381A>G位点与g.117686384A>G位点间完全连锁,g.117688503T>C位点与g.117686266T>C、g.117686381A>G和g.117686384A>G位点间不存在连锁关系,而其他各SNP位点间均存在强连锁不平衡关系。5个SNPs位点联合共检测到5种单倍型和10种双倍型,单倍型中以H5的频率最高(0.433)、H2的频率最低(0.059),双倍型中以H3H5的频率最高(0.221)、H1H4的频率最低(0.031)。5个SNPs位点在柯乐猪群体中均呈中度多态性(0.25<PIC<0.50),且其基因型分布均未偏离Hardy-Weinberg平衡(χ^(2)-HWE<5.991)。g.117688503T>C位点显著影响窝均产仔数和断奶仔猪数,TT基因型个体的窝均产仔数和断奶仔猪数显著高于CC基因型个体;g.117688518T>C位点显著影响断奶仔猪数,CC基因型个体显著高于TT基因型个体。柯乐猪TAC3R基因SNP位点双倍型与其繁殖性状的关联分析发现,H2H4型为窝均产仔数、窝均产活仔数和窝断奶仔猪数3个指标的最优双倍型,H1H3型为平均断奶重指标的最优双倍型。【结论】在柯乐猪TAC3R基因上检测到5个SNPs位点,其中g.117688503T>C和g.117688518T>C位点对柯乐猪的繁殖性能有显著影响。TAC3R基因可作为柯乐猪繁殖性状的候选基因,双倍型H2H4可作为分子标记辅助选择的参考。

水稻TAC1基因的STARP标记开发及164份杂交稻TAC1基因型分析

分蘖角度是水稻重要的株型性状,合适分蘖角是实现水稻高产的关键因素。针对控制水稻分蘖角度的主效基因TAC1的功能位点,设计了基于STARP(Semi-thermal asymmetric reverse PCR)技术的特异性分子标记S-TAC1,并对56份已测序常规水稻品种及164份杂交水稻进行了基因型鉴定。S-TAC1准确地鉴定了56个已测序常规品种的基因型,紧凑纯合基因型tac1/tac136份,松散纯合型TAC1/TAC120份,表明S-TAC1分型结果准确可靠。在164份杂交水稻中,杂合基因型TAC1/tac162份,松散纯合型TAC1/TAC1102份。本研究开发的功能标记为通过分子标记辅助选择培育理想株型的水稻品种提供了技术支撑。

利用错配碱基引物的ASO-PCR检测小麦赤霉病菌对多菌灵中抗菌株Codon^(200) TTC→TAC基因型

采用在引物3′端引入错配碱基,建立了特异性检测小麦赤霉病菌对多菌灵中抗菌株(Codon200TTC→TAC)基因型的ASO-PCR分子检测技术。结果表明含有错配碱基的引物对NT-7 R1/NT-7 Err5 F能够特异性检测小麦赤霉病菌对多菌灵的中抗菌株(Codon200TTC→TAC),扩增条件为94℃预热5 min;94℃变性60 S,56℃退火60 S,72℃延伸60 S,35个循环;最后72℃延伸15 min。并利用26种常见植物病原真菌验证了所设计引物的PCR扩增特异性。整个检测过程快速,操作简单,结果准确,在6小时内完成。

正常妊娠晚期和子痫前期胎盘TAC3基因的表达

目的探讨子痫前期患者胎盘组织中TAC3基因的表达以及其影响因素。方法分别收集同期分娩的正常晚期妊娠和足月子痫前期患者的胎盘标本各12例,取胎盘母面绒毛小叶,进行细胞培养后,分别实时定量PCR检测胎盘的TAC3基因表达,以及由缺氧和氧化应激引发的TAC3基因在胎盘表达的改变,并用单向方差分析与t检验比较2组的差异。结果①对照组及子痫前期组的足月胎盘中均检测到TAC3基因。2组足月胎盘TAC3mRNA在病例组高水平表达,为对照组的1.7倍,TACR3mRNA在2组间差异无显著性。②低氧环境(2%氧气)细胞滋养层TAC3mRNA的表达显著低于正常含氧环境生长的胎盘细胞滋养层(21%氧气)1.8倍。而在氧化或低氧应激下的合胞体滋养层TAC3的表达差异无显著性。同样条件下TACR3的表达也差异无显著性。结论TAC3表达的主要位点是胎盘,其表达在人子痫前期足月胎盘中极高,但低氧和氧化应激在体外不诱导TAC3的表达。

用克隆池PCR法筛选小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL基因组TAC文库获得抗病基因候选克隆

用根据抗病基因保守区设计的一对简并性引物 ,从小麦 簇毛麦易位系 6VS 6ALcDNA中PCR扩增获得一个具有抗病基因核苷酸结合位点 (Nucleotidebindingsite,NBS)结构特点的DNA片段克隆N7。从小麦 簇毛麦易位系6VS 6AL基因组TAC(Transformation competentartificialchromosome,TAC)文库的 2 2块 96孔板提取所有 2 112个克隆池(每个池含约 10 0 0个克隆 )的质粒 ,再根据N7的核苷酸序列设计一对特异引物 ,用克隆池PCR(pooledPCR)法经分级筛选从文库中获得一个阳性克隆。以N7为探针 ,通过Southern杂交证实了该TAC克隆为真正含有抗病候选基因的克隆。

柯乐猪TAC3第1内含子多态对繁殖性状的影响

TAC3基因参与哺乳动物繁殖相关的生命活动。试验以78头初产柯乐猪为材料,通过PCR产物直接测序和序列比对鉴定TAC3基因的遗传变异,分析遗传变异对繁殖性状的影响。结果显示,在柯乐猪TAC3基因第1内含子中检测到1个中度多态位点:g.22329038 T>C,产生3种基因型TT、TC和CC,TC和T分别为优势基因型和优势等位基因,基因型分布未偏离Hardy-Weinberg平衡,TT基因型个体的产活仔数显著高于CC基因型(P<0.05),其他指标在不同基因型间差异未能达到显著水平(P>0.05),揭示g.22329038 T>C位点可能是柯乐猪产活仔数的一个重要分子标记。

野生大豆核基因组Mb级DNA的制备与酶切

以野生大豆黄化幼苗为材料提取其细胞核DNA,经LMP包埋并用蛋白酶K裂解其中的核蛋白后,采用脉冲电泳回收2 Mb左右细胞核DNA。用HindⅢ对回收细胞核DNA进行部分酶切并用脉冲电泳回收酶切后的DNA片段,经电洗脱、浓缩和透析后DNA溶液浓度可达10 ng.μL-1。连接转化检测结果表明:该DNA可用于后续野生大豆基因组可转化人工染色体(TAC)文库的构建和基因组分析。

猪速激肽3基因启动子活性及其表达调控的初步研究

为了确定猪速激肽3基因（tachykinin3,TAC3）核心启动子区域,探索作用于该区域的转录因子对TAC3的调控作用,以猪耳组织DNA为模板,PCR扩增TAC3基因5＇端不同长度缺失片段,并构建至p GL3-basic载体,转染猪卵巢颗粒细胞,通过双荧光素酶活性分析确定核心启动子区域,染色质免疫共沉淀技术（Ch IP）验证转录因子与基因启动子区的作用,构建转录因子超表达载体和小干扰RNA（siRNA）转染至猪卵巢颗粒细胞,qRT-PCR检测TAC3基因mRNA表达变化。结果显示：成功构建了TAC3基因5＇端不同长度缺失片段,通过双荧光素酶报告系统分析发现,-1 310/-544区域为TAC3基因的核心启动子区,-2 486/-1 633区域可能存在负向调控元件,-1 310/-544区域可能存在正向调控元件。Ch IP检测发现转录因子C/EBPβ和YY1分别结合在TAC3基因的-653/-639和-873/-856区域;超表达C/EBPβ和YY1后,TAC3基因启动子活性显著升高（P〈0.05）、mRNA表达水平显著上调（P〈0.01）;干扰C/EBPβ后,TAC3基因mRNA表达水平显著下调（P〈0.01）;干扰YY1后,TAC3基因启动子活性显著降低（P〈0.05）。结果表明：转录因子C/EBPβ、YY1结合在TAC3基因的核心启动子区域,促进TAC3基因的转录活性。