TACI-Ig融合蛋白对小鼠视神经病理损伤的影响

目的·探讨腹腔注射TACI-Ig融合蛋白对小鼠视神经炎症浸润、髓鞘完整性等的影响。方法·将24只C57BL/6J小鼠随机分为4组,分别为空白对照组、生理盐水注射组、TACI-Ig低剂量注射组(0.4 mg/kg)、TACI-Ig高剂量注射组(4 mg/kg),每组6只。TACI-Ig隔日腹腔注射1次,生理盐水对照组按照同样方式注射生理盐水0.2 mL,空白对照组不给予任何干预。20日后将小鼠麻醉灌注,取眼球和视神经组织,石蜡包埋,切片后行苏木精-伊红(H-E)染色和固蓝(LFB)染色,分别观察炎症细胞浸润情况和髓鞘脱失情况。结果·H-E染色可见空白对照组和生理盐水对照组着色均匀,视神经纤维排列紧密、规则;TACI-Ig低剂量注射组(0.4 mg/kg)视神经结构与两对照组类似;高剂量注射组(4 mg/kg)细胞均匀分布,可观察到炎症细胞少量浸润,炎症细胞浸润评分与其他组比较无明显差异(P=0.610 3)。所有组别视网膜结构清晰、层次分明,神经节细胞单层紧密排列、胞体完整、胞核可见、分布均匀,各组实验动物视网膜各层结构相比较并无明显差异。经LFB染色后光学显微镜下观察,发现视神经髓鞘均无明显脱失和损伤情况,4组之间比较差异无统计学意义(P=0.473 6)。结论·低剂量(0.4 mg/kg)TACI-Ig腹腔注射对视神经、视网膜神经节细胞无损伤,高剂量(4 mg/kg)可能引起视网膜区域炎症少量浸润。

抗Ig融合蛋白Fc段单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究

目的 :制备并鉴定抗Ig融合蛋白Fc段的单克隆抗体 (mAb) ,建立用于检测Ig融合蛋白的夹心ELISA法和纯化Fc融合蛋白的亲和层析法。方法 :以hBCMA Ig融合蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠 ,通过细胞融合制备抗Fc段mAb ,用ELISA等方法鉴定mAb的Ig亚类、表位以及种属特异性 ,建立用于检测Ig融合蛋白的夹心ELISA法 ;Westernblot检测mAb对变性Ig融合蛋白的反应性。将mAb与Sepharose4B交联 ,制备亲和层析柱 ,对LAIR1 Ig融合蛋白进行纯化。 结果 :获得 7株稳定分泌抗Fc段mAb的杂交瘤 (FMUFc1～FMUFc7)。利用FMUFc4作为包被mAb ,FMUFc5作为酶标记mAb ,成功地建立了检测Ig融合蛋白的ELISA法 ,敏感度达到 2 μg/L ;在 7株mAb中 ,FMUFc6可用于Ig融合蛋白的Westernblot检测。用FMUFc6mAb制备的亲和层析柱 ,可有效地纯化LAIR1 Ig融合蛋白。结论 :成功地制备了抗Ig融合蛋白Fc段的mAb ,建立了可用于Ig融合蛋白检测和纯化的方法 。

Ig融合蛋白的应用研究进展

Ig融合蛋白是指在基因水平将目的基因同Ig部分片段基因相连 ,克隆并表达的重组蛋白。该蛋白具有目的蛋白的功能 ,又获取Ig的新特性。本文综述了Fab融合蛋白及Fc融合蛋白在临床及科学研究应用方面的进展。

ICOS-Ig融合蛋白阻断ICOS信号通路可抑制异基因反应性T淋巴细胞的功能

本研究探讨ICOS-Ig融合蛋白阻断ICOS-B7h信号通路对异基因反应性T淋巴细胞的作用和机制。建立稳定高表达ICOS-Ig的CHO细胞株,培养制备纯化的ICOS-Ig融合蛋白;以C57BL/6小鼠脾脏来源的CD4+淋巴细胞为反应细胞,BABL/C骨髓源成熟树突状细胞为刺激细胞,应用不同浓度梯度的ICOS-Ig干预,以相同浓度的人Ig作为对照。结果显示:获得的目标蛋白的分子量为54kD,内毒素含量<10EU/ml。ICOS-Ig在≥10μg/ml时可显著减少DC刺激引起的异基因反应性T淋巴细胞的增殖效应(p<0.01)。ICOS-Ig不影响T淋巴细胞的活化,ICOS-Ig浓度与CD4+ T淋巴细胞的凋亡成正相关。单纯刺激组、ICOS-Ig10μg/ml和20μg/ml干预组的CD4+Annexin V+PI-细胞群的频率分别为15.1%、26.4%和33.6%。ICOS-Ig作用后,Th1细胞因子TNFα分泌降低,Th2细胞因子IL-4分泌增加。结论:ICOS-Ig融合蛋白阻断ICOS通路可明显减弱异基因反应性T淋巴细胞的增殖反应,并改变Th细胞的极化,对CD4+ T淋巴细胞的活化无影响,但可促进活化的T淋巴细胞凋亡。

LTβR-Ig融合蛋白的真核表达及其体外生物学功能的研究

目的为了研究LTβR-Ig的生物学功能,构建重组的LTβR-Ig/pcDNA3.1(+)真核表达载体,在CHO细胞中表达,无血清扩大培养,并初步研究了融合蛋白LTβR-Ig的体外生物学活性。方法将鼠LTβR胞外段cDNA与人IgG1 Fc段cDNA共同克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),转染CHO-K细胞表达,阳性克隆进行无血清培养,采用PtoteinA亲和层析的方法进行纯化;3[H]TdR参入法检测对细胞增殖的影响。结果经PCR和限制性酶切鉴定以及DNA测序,结果表明克隆了正确序列的LTβR胞外段序列,成功构建了重组表达质粒LTβR-Ig/pcDNA3.1,并在CHO细胞中稳定表达了LTβR-Ig的融合蛋白,证明LTβR-Ig融合蛋白能抑制混合淋巴细胞反应。结论本研究建立了能稳定表达有生物活性的LTβR-Ig融合蛋白的真核表达系统,为今后研究LTβR在移植排斥中的作用机制,及开展基因重组药物进行疾病的生物治疗奠定了基础。

CTLA4Ig融合蛋白在CHO细胞中的表达

CTLA4Ig是人CTLA4胞外区与人免疫球蛋白铰链区、CH2区、CH3区组成的融合蛋白,可以与B7结合,通过阻断B7与CD28的结合,从而阻断B7介导的T细胞活化必需的共刺激信号,可作为免疫抑制剂用于器官移植。将CTLA4Ig融合分子克隆到真核表达载体pCI-dhfr,并用脂质体方法转染到COS7和CHO-dhfr-细胞中,用氨甲喋呤筛选转染的CHO-dhfr-细胞。用RT-PCR、ELISA、细胞免疫荧光染色和Western-blot鉴定重组蛋白的表达。采用A蛋白纯化重组蛋白。

大鼠IgECH2-3-FasL融合蛋白基因转染对RBL-2H3的影响

目的:探索大鼠IgECH2-3-FasL融合蛋白对大鼠肥大细胞株RBL-2H3诱导凋亡作用和抑制其脱颗粒作用。方法:将本室构建的真核表达质粒pcDNA3.1/IgECH2-3-FasL转染肥大细胞株RBL-2H3,RT-PCR及免疫印迹法鉴定大鼠IgECH2-3-FasL融合蛋白的表达,AnnexinⅤ流式细胞分析融合蛋白对RBL-2H3的凋亡作用,通过组胺释放率的测定,分析融合蛋白对RBL-2H3脱颗粒的阻断作用。结果:大鼠IgECH2-3-FasL以融合蛋白的形式在RBL-2H3上获得表达,并且诱导RBL-2H3凋亡,部分阻断了RBL-2H3的脱颗粒。结论:大鼠IgECH2-3-FasL融合蛋白具有促进肥大细胞凋亡和抑制肥大细胞脱颗粒的双重作用。

鸡Igλ轻链绿色荧光蛋白融合分子在COS7细胞膜的表达

将牛IgG Fc受体γRⅡ的跨膜区序列嵌合入鸡Igλ轻链基因中,并将鸡Igλ轻链信号肽与Pegfp-C1载体的绿色荧光蛋白N端融合产生带有信号肽的中间载体Pegfp-C1-SP。鸡Igλ轻链基因嵌合分子定向克隆入载体的多克隆位点,构建了带有信号肽的鸡Igλ轻链/GFP融合蛋白真核表达载体。转染COS7细胞后,荧光显微镜观察,重组鸡Igλ轻链/GFP蛋白在COS7细胞膜及膜周围有明显表达,而载体pEGFP-C1转染的COS7细胞GFP则分布在细胞及细胞核。结果表明,牛IgG Fc受体γRⅡ的跨膜区能介导融合蛋白在细胞膜上的表达。

单克隆抗体和Ig融合蛋白治疗银屑病的有效性和长期安全性

银屑病是一种慢性T细胞介导的炎性皮肤病,发病机理尚不完全清楚,目前所采用的化学药物的疗效也欠佳,本文综述了近年新研制的单克隆抗体、融合蛋白等生物制剂,它们由于疗效高,副作用少,有可能成为银屑病治疗的更好选择。

CTLA-4 Ig融合蛋白抗小鼠同种心脏移植排斥的效果及其机制

目的 :研究细胞毒性 T淋巴细胞相关抗原 4(CTL A - 4,CD15 2 ) Ig融合蛋白 (CTL A- 4Ig)抗小鼠同种心脏移植排斥的效果及其体内作用的机制。 方法 :以 C5 7BL / 6小鼠为供者 ,BAL B/ c小鼠为受者行异位心脏移植术 ,分别腹腔注射 CTL A-4Ig[10 0μg/ d,共 15次 ]、γ-球蛋白对照抗体及 PBS,观察移植供心的存活时间 ;研究腹腔注射 CTL A- 4Ig后受体小鼠 T细胞对同种抗原反应性的变化以及对 T细胞亚群分化的影响。结果 :同种心脏移植的小鼠腹腔注射 CTL A- 4Ig后 ,移植心脏存活时间较对照组显著延长 ,40 %移植心脏的存活时间长达 2个月以上。 CTL A- 4Ig治疗后诱导受体小鼠 T细胞对同种抗原低反应性 ,但对第三者抗原的反应性无影响。受体血清中的 Th1来源的 IL - 2、IFN-γ均明显低于 PBS对照组 ,而 Th2来源的 IL - 10的水平则明显高于对照组 ,IL- 4未见明显的改变。结论 :CTL A- 4Ig治疗后可通过诱导受体小鼠 T细胞对同种抗原低反应性以及受体 T细胞由 Th1向 Th2分化 ,诱导供者特异性免疫耐受的产生 。

人TACI-linker-BR3双受体融合基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达

目的:构建人双受体融合基因真核表达载体———pcDNA3.1(+)-TACI-linker-BR3-IgGFc,观察其在COS-7细胞中的表达。方法:应用基因工程技术构建重组载体,脂质体转染COS-7细胞,通过Western印迹、ELISA以及免疫组化方法,检测目的蛋白的表达及其与BAFF、APRIL蛋白相互作用情况。结果:融合基因在瞬时转染的真核细胞中获得表达,并分泌至上清,转染效率能达到48%,融合蛋白能与BAFF、APRIL蛋白有效结合而且融合蛋白中分子标签IgGFc未影响双受体融合蛋白的结构及其生物学活性。结论:人TACI-linker-BR3双受体基因与IgGFc融合基因载体构建成功,表达的融合蛋白具有生物学活性,为进一步探讨SLE等自身免疫疾病的发病机制和生物学治疗方法奠定了基础。

TACI—Ig取得进展

Zymogenetics公司和Serono公司在2006年6月份的EULAR会议上公布了其可溶蛋白TACI-Ig（Ⅰ）的早期阳性结果后，计划将该产品推人到治疗类风湿性关节炎的Ⅰ期研究中。

日本血吸虫特异性IgE相关抗原编码基因的克隆和鉴定

目的 从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选并克隆日本血吸虫特异性IgE相关抗原编码基因。 方法 用ABC ELISA法从日本血吸虫病流行区筛选出高水平抗血吸虫成虫抗原IgE抗体的个体 15人 ,采集血清并混合。混合血清经Protein G柱吸收后 ,用于日本血吸虫成虫cDNA文库的免疫学筛选。PCR扩增阳性克隆插入cDNA片段。序列分析后 ,于该序列第一开读框两端设计引物并分别引入EcoRⅠ和NotⅠ位点 ,PCR扩增并纯化目的基因片段后克隆入质粒载体pGME T ,再亚克隆入表达载体pGEX 6p 1。经IPTG诱导表达 ,对表达产物进行SDS PAGE和Westernblotting鉴定。 结果 阳性克隆插入片段约 12 0 0bp ,第一开读框长 5 0 7bp ,编码 16 9个氨基酸 ,理论分子量为 19 3kDa。DNA序列分析显示 ,与已知序列同源性小于 4 0 %。重组质粒pGEX 6p 1/Sj4 3B能高效表达融合蛋白 ,且能被日本血吸虫特异性IgE抗体识别。 结论 成功构建的重组质粒pGEX 6p 1/Sj4 3B ,Sj4

核小体Th表位和CTLA4Ig双基因共表达真核表达载体的构建

目的将核小体Th表位与CTLA4Ig融合基因融合,研究CTLA4Ig作为真核表达载体的可行性。方法用touchdownPCR法扩增CTLA4Ig基因,同时引入核小体Th表位(H2B14-28)。将PCR产物连接真核表达载体pcDNA3.1穴+雪,构建pcDNA3.1穴+雪-CTLA4Ig-H2B。将表达质粒转染COS-7细胞,Westernblot检测转染细胞裂解上清中融合蛋白的表达。将构建表达CTLA4Ig-H2B的减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207喂饲BALB/c小鼠,取脾脏进行免疫组化鉴定重组蛋白在动物体内的表达。结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功。在pcDNA3.1穴+雪-CTLA4Ig-H2B质粒转染后48h细胞裂解上清中,检测到CTLA4Ig融合蛋白的表达,该蛋白能与抗人CTLA-4单抗特异结合。重组蛋白在BALB/c小鼠脾脏免疫细胞胞浆中有阳性表达。结论成功构建了能稳定表达核小体Th表位和CTLA4Ig融合基因的真核表达载体。

IL-1ra-Fcε融合基因的克隆、表达及鉴定

白细胞介素-1与免疫球蛋白E在过敏性哮喘发病中发挥着重要作用。本试验克隆了白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)及IgE分子恒定区cDNA片段,构建了融合基因原核表达载体IL-1ra-Fcε/pBV220。将其转化大肠杆菌BL21(DE3),实现了融合蛋白的高效表达,Western blotting结果表明表达蛋白为目的融合蛋白,主要以包涵体形式存在;利用分子筛和阳离子交换层析对表达产物经进行了纯化,纯化的包涵体复性后经体外功能试验表明,融合蛋白的活性与IL-1ra没有显著性差异;初步药代动力学分析显示IL-1ra-Fcε半衰期比IL-1ra延长了4.78倍。

Ad-CTLA-4Ig基因导入对胰十二指肠移植大鼠免疫耐受的实验研究

目的研究基因转导法导入细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4融合蛋白基因(CTLA-4Ig)对诱导大鼠胰腺移植免疫耐受的作用。方法采用链脲霉素60mg/kg尾静脉一次性注射法诱导建立Wistar大鼠型糖尿病模型。以SD大鼠为供体,糖尿病Wistar大鼠为受体,用体外低温保存状态下对供器官行腺病毒介导CTLA-4Ig基因转导制作异基因大鼠胰十二指肠移植动物模型。术后监测血糖,记录大鼠功能性存活期。术后3、10、17、28d经大鼠眶后静脉取血,应用ELISA法检测血清IL-2表达,Western blot检测人CTLA-4Ig的蛋白表达。结果对照组大鼠功能性存活期为(11±1)d,转导组功能性存活期为(33±4)d(P<0.01);对照组大鼠术后血清中未检测到人CTLA-4Ig蛋白表达,所有转导组存活病例,第10d血清中均有人CTLA-4Ig表达;转导组术后第3d、第10d血清IL-2分别为(33.710±7.803)pg/mL、(47.846±14.050)pg/mL,小于对照组(P<0.01)。结论体外低温保存状态下对供器官行腺病毒介导人CTLA-4Ig基因转导,可以延长大鼠胰十二指肠移植术后功能性存活期,诱导免疫耐受。

CTLA-4Ig与ICAM-1单抗联合DCp诱导同种移植耐受

目的:利用细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 Ig融合蛋白(CTLA-4 Ig)和细胞问黏附分子1(ICAM-1)单克隆抗体联合治疗经供者树突状细胞前体(DCp)免疫的移植受者诱导移植耐受。方法:实验分4组:对照组、CTLA-4 Ig组、ICAM-1单抗组和联合组,每组8只BALB／c受鼠。每组均以2×106C57BL／6供者DCp经尾静脉输注受鼠。CTLA-4 Ig组和ICAM 1单抗组分别自DCp输注之日起连续2周向受鼠腹腔内注射CTLA-4 Ig或ICAM-1单抗(0.1 mg／d);联合组以同样剂量两药注射2周;对照组则仅输注DCp。DCp输注1周后4组均行异位心脏移植并观察移植心存活时间,进一步作皮肤移植确认耐受状态。结果:对照组、ICAM-1单抗组和CTLA-4 Ig组的C57BL／6供心平均存活时间分别为(20.13±1.64)d、(45.00±2.62)d和(90.00±3.07)d,联合组8例中除1例存活98 d外,其他7例均超过100 d。前3组C57BL／6来源皮肤平均存活时间分别为(4.25±0.89)d、(9.00±0.76)d和(44.50±3.42)d,联合组8例中1例存活91 d,3例存活95 d,其他4例均超过100 d。结论:在供者DCp输注受者后以ICAM-1单抗和CTLA-4 Ig联合处理受者能够诱导针对供者的耐受状态。

CTLA-4/Ig在CHO/DG44细胞中的高效表达

目的研究CTLA-4/Ig融合蛋白在CHO真核表达系统中的表达,并纯化所表达的CTLA-4/Ig融合蛋白,为其功能研究和临床应用奠定基础。方法将线性化的pMM-CTLA-4-IgG4/WG和pMMGR转染CHO/DG44细胞,对阳性克隆进行无血清悬浮培养,Western blot检测细胞培养液中CTLA-4/Ig融合蛋白的表达,筛选出高效稳定表达CTLA-4/Ig融合蛋白的CHO细胞;Protein A亲和层析纯化所表达的CTLA-4/Ig融合蛋白;SDS-PAGE电泳、Western印迹等对纯化的CTLA-4/Ig融合蛋白的相对分子质量、纯度、抗原特异性进行生物学鉴定。结果筛选出了能高效稳定表达CTLA-4/Ig融合蛋白的CHO细胞;纯化后的CTLA-4/Ig融合蛋白在SDS-PAGE电泳后出现一条与预期相对分子质量大小相符的蛋白条带;该蛋白能与羊抗人IgG-HRP抗体特异结合。结论获得了能够高效稳定表达具有生物学活性的CTLA-4/Ig融合蛋白的CHO细胞。

CD_(40) Ig融合蛋白阻断共刺激信号通路对病毒性心肌炎小鼠的治疗作用

目的探讨CD40Ig融合蛋白(简称CD40Ig)对柯萨奇B3病毒(CVB3)所致病毒性心肌炎(VMC)小鼠死亡率、心肌病理改变和病毒复制的影响。方法106只4～6周龄健康雄性BALB/c小鼠,体质量12～16 g,随机分为CD40Ig组(16只)、病毒组(40只)、IgG组(40只)及正常对照组(10只)。CD40Ig组、病毒组和IgG组小鼠腹腔注射半数组织细胞感染量(TCID50)为10-3L-1的CVB30.15 mL,正常对照组小鼠接种0.15 mL不含病毒的Eagle液。CD40Ig组、IgG组小鼠于接种病毒后6 h、72 h分别注射CD40Ig(0.1 mg.kg-1)及IgG(0.1 mg.kg-1)。接种病毒后第7天处死所有小鼠。在光镜下观察其心肌病理变化,并计算心肌病理组织学积分;采用实时荧光定量PCR检测其心肌组织中CVB3mRNA的表达;采用免疫组织化学法检测其心肌组织中CD40蛋白表达。结果1.与病毒组比较,CD40Ig组小鼠死亡率降低(80.0%vs50.0%,P<0.05)、心肌病理组织学积分下降[(8.88±2.95)分vs(3.42±1.21)分,P<0.05]、心肌CVB3mRNA表达减少(3.48±2.89vs0.91±0.75,P<0.05);2.病毒组和CD40Ig组小鼠心肌组织均有CD40蛋白表达,CD40主要表达于心肌组织中浸润炎性细胞胞膜表面,并且在VMC小鼠的心肌细胞胞膜/胞质中也可见大量CD40蛋白表达。结论CD40Ig可减轻VMC小鼠心肌炎性反应,降低心肌病毒复制及死亡率,其机制可能与CD40Ig阻断CD40和CD40L的相互作用,抑制T淋巴细胞活化有关。