大鲵Tafazzin基因及其全长cDNA的克隆及序列分析

实验采用兼并性PCR和末端快速扩增（RACE）的方法，得到了1432bp的大鲵AndriasdavidanusTAZ基因全长cDNA序列。该序列包括87bp的5’末端非翻译区（UTR），534bp的3’UTR及789bp的开放阅读框（ORF），NCBI数据库接收号KFll2047，编码263个氨基酸，预测其蛋白质分子量约为30．55KD，等电点约为8．87。通过搜索NCBI的nr数据库获取同源序列进行氨基酸相似性比对，并构建TAZ氨基酸序列的系统进化树，结果表明，大鲵TAZ与斑马鱼（Daniorerio）、爪蟾（Xenopustropicalis）、人（Homosapiens）等的TAZ蛋白同源性在68％～80％之间，在系统树上也与爪蟾关系最近，处于鱼类与爬行动物、鸟类及哺乳动物之间，反应了大鲵在进化上的过渡状态。

Tafazzin在口腔鳞状细胞癌中的表达及其与MAC30的相关性研究

目的研究Tafazzin在口腔鳞状细胞癌(OSCC)中的表达及其与MAC30的相关性。方法采用免疫组化ABC法检测Tafazzin在24例正常口腔黏膜和59例OSCC组织中的表达,分析其与患者年龄、性别、肿瘤分化程度及淋巴结转移等临床病理特征的关系及其与MAC30在OSCC中的相关性。结果Tafazzin在OSCC中的阳性表达率明显高于其在正常口腔黏膜中的表达率,差异有统计学意义(66.1%vs 8.3%,P=0.000);在OSCC中,Tafazzin在低分化患者中的阳性表达率明显高于其在高分化患者中的阳性表达率(88.9%vs 56.1%,P=0.014);其在伴淋巴结转移患者中的阳性表达率高于其在无淋巴结转移患者中的阳性表达率(86.4%vs 54.1%,P=0.011);Tafazzin的表达与患者性别、年龄、部位、肿瘤大小无相关性(P>0.05)。Tafazzin与MAC30在OSCC中的表达呈正相关(r=0.492)。结论Tafazzin可能在OSCC的发生、发展及淋巴结转移中起重要的作用,有望成为预测OSCC发生、发展及预测淋巴结转移的新的潜在生物标志物,其作用机制可能与MAC30在OSCC中的正协同作用有关。

一个TAFAZZIN基因新变异引起的Barth综合征患儿家系的遗传学分析

目的对1例患有发育迟缓的男性儿童及其家系进行遗传学分析,明确其病因并为其预后治疗提供依据。方法获取患儿全血进行全外显子高通量测序分析,应用Sanger测序验证患儿及其父母疑似致病基因变异位点,并辅助尿有机酸检测进一步确认。结果患儿窦性心动过速、ST-T改变,全外显子组测序提示TAFAZZIN基因变异,Sanger测序结果显示胎儿携带TAFAZZIN基因c.108del(p.Lys37Serfs*3)半合子变异,为未报道的新变异,其母为c.108del(p.Lys37Serfs*3)杂合变异携带者。尿有机酸分析显示3-甲基戊烯二酸指标轻度升高,3-甲基戊二酸指标升高,综合诊断为Barth综合征。结论TAFAZZIN基因c.108del(p.Lys37Serfs*3)变异是该患儿生长缓慢的致病原因,基因检测结果为该患儿后续治疗及该家系遗传咨询提供依据。

微小RNA-125a-5p对人鼻咽癌细胞增殖的影响及机制

目的探究微小RNA-125a-5p(miR-125a)对人鼻咽癌细胞(HK-1细胞)增殖的影响及机制。方法常规培养HK-1细胞及人胚肾细胞永生化细胞系(293T细胞),将HK-1细胞随机分为对照1组、过表达miR-125a组(转染miR-125a mimics)、沉默miR-125a组(转染miR-125a inhibitor);另取部分HK-1细胞随机分为对照2组、miR-125a过表达组(转染miR-125a mimics)及回补组[转染miR-125a mimics同时过表达含PDZ结合基序的转录共激活因子(TAZ)]。转染48 h后检测miR-125a表达验证转染效率。用RT-qPCR法检测miR-125a-5p、TAZ mRNA;用Western blotting法检测TAZ蛋白;CCK-8实验、集落形成实验检测细胞增殖能力;通过预测网站TargetScan(http://www.targetscan.org/)和miRDB(http://mirdb.org/)预测miR-125a与TAZ的结合位点。将293T细胞随机分为4组,WT+miR-ctrl组共转染TAZ野生型(TAZ-WT)和miR-125a空载对照(miR-ctrl)、Mut+miR-ctrl组共转染TAZ突变型(TAZ-MUT)和miR-ctrl、WT+miR-125a组共转染TAZ-WT和miR-125a模仿物(miR-125a)、Mut+miR-125a组共转染TAZ-MUT和miR-125a,用双荧光素酶报告基因实验进一步验证miR-125a的下游靶点。结果对照1组、过表达miR-125a组、沉默miR-125a组miR-125a的相对表达量比较差异有统计学意义(P均<0.05)。对照1组、过表达miR-125a组、沉默miR-125a组转染后第2、3、4、5、6天增殖活力(OD450值)比较差异均有统计学意义(P均<0.05)、集落形成数比较差异有统计学意义(P均<0.05)。对照1组、过表达miR-125a组、沉默miR-125a组TAZ蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(P均<0.05)。网站预测显示miR-125a与TAZ存在结合位点,设计突变型序列(TAZ-3’UTR MT),miR-125a与TAZ的非编码区结合,miR-125a的直接下游靶点为TAZ。WT+miR-125a组相对荧光强度低于WT+miR-ctrl组、Mut+miR-ctrl组(P均<0.05),Mut+miR-125a组相对荧光强度与WT+miR-ctrl组、Mut+miR-ctrl组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。对照2组、miR-125a mimics组、miR-125a mimics+TAZ组转染后第2、3、4、5、6天增殖活力比较差异有统计学意义(P均<0.05),集落形成数比较差异有统计学意义(P均<0.05)。结论miR-125a可抑制鼻咽癌细胞增殖,其作用机制与抑制其下游靶点TAZ的表达有关。

过表达TAZ促进口腔舌鳞癌细胞增殖迁移和侵袭的作用机制研究

目的:探究过表达Tafazzin(TAZ)对口腔舌鳞癌CAL-27、SCC-15细胞增殖迁移侵袭的影响及其作用机制。方法:利用成功过表达TAZ的慢病毒载体转染CAL-27、SCC-15细胞,分为过表达TAZ组(overexpression TAZ,OE TAZ)和对照组(negative control,NC)。用CCK-8实验检测细胞增殖;用划痕实验检测细胞的迁移;用Transwell实验检测细胞侵袭。相关基因的mRNA水平和蛋白水平分别利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测。结果:qRT-PCR和Western blot结果显示,过表达TAZ病毒转染成功;过表达组较对照组增殖升高,迁移侵袭明显增强;增殖相关蛋白p-Erk,p-Akt表达量升高,上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白E-钙黏连蛋白(E-Cadherin)降低,波形蛋白(Vimentin)升高。结论:过表达TAZ可能通过影响p-Erk、p-Akt、E-Cadherin、Vimentin的表达促进口腔舌鳞癌CAL-27、SCC-15细胞的增殖迁移和侵袭。

TAZ原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

通过PCR方法扩增心磷脂酰基转移酶全长基因tafazzin,将其插入到原核表达载体p EASY中。经菌落PCR筛选阳性克隆,并通过DNA测序确定原核表达载体p EASY-TAZ构建成功。将p EASY-TAZ分别转入大肠杆菌(E.coli)感受态细胞BL21(DE3)、BL21(DE3)pLys S和Transetta(DE3)中,以不同浓度的IPTG在不同温度条件下诱导TAZ蛋白表达,选择蛋白表达量较高的Transetta(DE3)菌株作为工程菌。结果显示,重组蛋白表达量随IPTG浓度的提高而增加;温度对TAZ蛋白原核表达有重要影响,低温条件(16℃)可以提高重组蛋白的可溶性。经Western blot试验证实重组蛋白TAZ表达成功。