丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因TAHCCP2的克隆

目的:筛选与克隆 HCV 核心蛋白反式激活新型靶基因.方法:以 HCV 核心蛋白表达质粒 pcDNA3.1(-)-core 转染HepG2细胞,以空载体 pcDNA3.1(-)为平行对照,提取 mRNA 并进行抑制性消减杂交(SSH)分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,从转染 pcDNA3.1(-)-core 的 HepG2细胞提取总 RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实.结果:新基因命名为 TAHCCP2,编码序列全长为429个核苷酸(nt),编码产物由142个氨基酸残基(aa)组成,测序证实 TAHCCP2克隆正确.在 GenBank 中注册,注册号为 AY039043.结论:筛选与克隆 HCV 核心蛋白反式激活新型靶基因TAHCCP2,为进一步研究 HCV 核心蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.

基因表达谱芯片技术筛选丙型肝炎病毒核心蛋白反式调节基因TAHCCP2的调节基因

目的:应用基因表达谱芯片技术了解TAHCCP2在肝细胞中可能上调或下调的基因,了解其可能的调节功能线索. 方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinfo- rmatics)技术筛选并克隆HCV核心蛋白反式激活的新型靶基因TAHCCP2.以TAHCCP2表达质粒pcDNA3.1(-)- TAHCCP2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA.应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析. 结果:TAHCCP2表达载体pcDNA3.1(-)-TAHCCP2经酶切鉴定和DNA测序鉴定正确.经基因表达谱芯片分析,4种基因的表达水平下调. 结论:筛选到的一些与体内氧化应激、细胞生长和能量代谢相关的基因,推测了TAHCCP2可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.

应用抑制性消减杂交技术筛选TAHCCP2的反式调节基因

目的:筛选与克隆TAHCCP2的反式激活基因,了解其可能存在的调节功能线索.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioin-formatics)技术筛选并克隆TAHCCP2反式激活的新型靶基因.以TAHCCP2表达质粒pcDNA3.1(-)-TAHCCP2转染HepG2细胞.以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组.分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR).将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人TAHCCP2反式激活基凶差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到70个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列.结果共获得15种编码基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了TAHCCP2可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.

丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因2表达产物的亚细胞定位

目的研究HCV核心蛋白反式激活基因2(TAHCCP2)在细胞内的表达及表达产物的亚细胞定位。方法构建HBeAgTP基因的绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1-TAHCCP2,转染HepG2细胞,24h后荧光显微镜下观察表达蛋白的亚细胞定位。结果成功构建出TAHCCP2基因的绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1-TAHCCP2,其表达的蛋白定位于细胞核。结论TAHCCP2基因可表达TAHCCP2蛋白且定位于细胞核。