草鱼TAB2与TAK1蛋白互作鉴定及其对两种抗菌肽基因表达的影响

为了探究草鱼TAB2(Ci TAB2)与Ci TAK1能否互作及其对2种草鱼抗菌肽基因(Cihepcidin与Ciβ-defensin1)表达的影响,实验首先采用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析拟态弧菌感染后Citab2和Citak1在草鱼免疫相关组织中的时空表达模式。然后利用荧光共定位、免疫共沉淀及Western blot技术鉴定Ci TAB2与Ci TAK1在细胞内共定位及相互作用情况。最后将过表达质粒pEGFP-N1-Citak1与pEGFP-N1-Citab2共同转染草鱼肾细胞(CIK细胞),检测Cihepcidin与Ciβ-defensin1的相对mRNA表达水平。结果显示,拟态弧菌感染能够显著改变Citab2和Citak1的相对表达水平,前者于感染后不同时间在各检测组织中表现出不同的时空表达模式,而后者均呈现先上调后下调的表达模式;荧光显微镜下观察到Ci TAB2与Ci TAK1共定位于转染后的HEK293T和CIK细胞的胞质中,且在HEK293T细胞内能够形成Ci TAB2-Ci TAK1蛋白复合物;共同过表达Ci TAB2与Ci TAK1后,CIK细胞内Cihepcidin与Ciβ-defensin1的相对mRNA表达水平在各检测时间点均显著上调。结果表明,Ci TAB2与Ci TAK1存在互作关系且二者互作能够促进上述两种抗菌肽的转录表达。本研究从蛋白互作调控抗菌肽表达的角度为防治鱼类弧菌病提供了新策略。

视黄醇结合蛋白1通过激活TAK1促进大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大

目的:探究视黄醇结合蛋白1(retinol binding protein 1, Rbp1)在大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大中的功能和机制。方法:本研究通过联合分析基因表达数据库(Gene Expression Omnibus, GEO)中的小鼠心肌肥厚基因芯片数据,寻找在心肌肥厚发生过程中的关键调控因子,构建该基因过表达及敲减腺病毒并感染大鼠乳鼠原代心肌细胞,利用血管紧张素II(angiotensin II, Ang II)诱导大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大模型,研究目的基因对大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大的影响,应用Western blot及RT-qPCR探究目的基因调控大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大的分子机制。结果:在小鼠心肌肥厚心脏组织中Rbp1的表达显著上调(P<0.01),体外细胞实验显示与对照组相比,Rbp1过表达组的大鼠乳鼠原代心肌细胞面积显著增大,心肌肥厚标志基因心钠肽(atrial natriuretic peptide, Anp)和肌球蛋白重链7(myosin heavy chain 7, Myh7)的表达显著升高(P<0.01),证实Rbp1过表达能促进Ang II诱导的大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大;相反,Rbp1敲减则能显著抑制Ang II诱导的大鼠乳鼠原代心肌细胞面积增加和心肌肥厚标志物表达。机制研究显示,Rbp1过表达显著激活转化生长因子β激活激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1, TAK1)和P38(P<0.01),应用TAK1抑制剂可阻断Rbp1过表达对Ang II诱导大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大的促进作用。结论:Rbp1可通过激活TAK1信号通路促进Ang II诱导的大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大。

干扰TAK1通过下调TAB2/3来抑制肺成纤维细胞的增殖、侵袭、迁移和纤维化

目的探讨转化生长因子β激活激酶1(TAK1)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人胚肺成纤维细胞(HFL-1)的增殖、侵袭、迁移和纤维化的影响及其与TAK1结合蛋白(TAB)2/3的关系。方法将细胞分组分为Control组(未处理HFL-1)、TGF-β1组(10ng/mL TGF-β1诱导HFL-1)、TGF-β1+si-NC组(转染si-NC+TGF-β1诱导)、TGF-β1+si-TAK1组(转染si-TAK1+TGF-β1诱导)、TGF-β1+si-TAK1+pcDNA3.1组(转染si-TAK1+pcDNA3.1+TGF-β1诱导)、TGF-β1+si-TAK1+pcDNA3.1-TAB2组(转染si-TAK1+pcDNA3.1-TAB2+TGF-β1诱导)、TGF-β1+si-TAK1+pcDNA3.1-TAB3组(转染si-TAK1+pcDNA3.1-TAB3+TGF-β1诱导)。采用Western Blot和RT-qPCR检测TAK1和TAB2/3的表达。CCK-8检测细胞增殖。Transwell和细胞划痕实验检测细胞的侵袭和迁移能力。Western Blot检测迁移和纤维化相关蛋白的表达。免疫共沉淀验证TAK1和TAB2/3之间的关联。结果与Control组比,TGF-β1诱导后TAK1及TAB2/3表达升高(P均<0.05)。TGF-β1+si-TAK1组与TGF-β1+si-NC组相比其增殖、侵袭、迁移能力明显下降,迁移及纤维化相关蛋白表达明显下降(P均<0.05)。TGF-β1+si-TAK1+pcDNA3.1-TAB2/3组与TGF-β1+si-TAK1+pcDNA3.1组比增殖、侵袭、迁移能力上升,迁移及纤维化相关蛋白表达上升(P<0.05)。结论干扰TAK1通过下调TAB2/3来抑制TGF-β1诱导的肺成纤维细胞的增殖、侵袭、迁移和纤维化。

牛源TAK1基因慢病毒载体构建及其在MDBK细胞中的表达

为了探究转化生长因子-β激活蛋白1(TAK1)在牛疱疹病毒1型(BHV-1)感染中的作用,构建牛源TAK1基因慢病毒载体,筛选TAK1基因稳转过表达细胞株。根据GenBank中牛源TAK1基因序列(登录号:NM-001081595.1)设计引物,PCR扩增目的片段后插入载体中,构建pCDH-CMV-TAK1-MCS-EF1-turboRFP-T2A-Puro慢病毒质粒,将其导入293T细胞进行慢病毒包装及滴度测定。用包装好的慢病毒感染牛肾上皮细胞(MDBK),筛选过表达TAK1基因的稳转细胞株,通过荧光显微镜和免疫印迹试验(Western blot)进一步验证该基因的过表达。重组质粒双酶切与测序结果表明成功建立了pCDH-CMV-TAK1-MCS-EF1-turboRFP-T2A-Puro慢病毒质粒。慢病毒滴度测定结果显示,过表达TAK1基因组病毒滴度为1.0×108 TU/mL,空载体对照组病毒滴度为5.0×108 TU/mL。重组慢病毒以MOI 180转染MDBK细胞,荧光显微镜观察到明显的红色荧光,表明慢病毒质粒转染成功。Western blot结果显示,在相应分子量处检测到目的条带,进一步表明TAK1基因被表达。成功构建了pCDH-CMV-TAK1-MCS-EF1-turboRFP-T2A-Puro慢病毒质粒,并筛选出了过表达TAK1基因的MDBK稳转细胞株,为深入研究TAK1在BHV-1感染中机制的研究奠定基础。

基于TLR3/TAK/NF-κB信号通路探究壮宣饮对H1N1流感病毒性肺炎大鼠肺损伤的保护作用

目的探讨壮宣饮对H1N1流感病毒性肺炎大鼠肺损伤及TLR3/TAK1/NF-κB信号通路的影响。方法将大鼠随机分为对照组、模型组、奥司他韦组(135 mg/kg)和壮宣饮高、中、低剂量组(140、70、35 g/kg),每组12只。采用甲型流感病毒H1N1滴鼻法建立流感病毒性肺炎大鼠模型,造模24 h后灌胃给予相应剂量药物。给药5 d后观察大鼠一般状态变化,检测大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中TNF-α、IFN-γ、IL-6水平,计算肺湿/干重比,HE染色观察大鼠肺组织病理学变化,RT-qPCR法检测肺组织H1N1病毒载量,Western blot法检测肺组织TLR3/TAK1/NF-κB信号通路相关蛋白表达。结果与对照组比较,模型组大鼠精神萎靡、毛色无光泽、呼吸加快、行动迟缓、体质量下降,肺湿/干重比值和BALF中TNF-α、IFN-γ、IL-6水平升高(P<001),肺组织病理学评分、H1N1病毒载量、TLR3、p-IκBα蛋白表达及p-TAK1/TAK1、p-NF-κB p65/NF-κB p65比值升高(P<001),IκBα蛋白表达降低(P<001);与模型组比较,奥司他韦组和壮宣饮各剂量组大鼠精神状态良好,皮毛有光泽,呼吸较平稳,体质量增加,肺湿/干重比值和BALF中TNF-α、IFN-γ、IL-6水平降低(P<005,P<001),肺组织病理学评分、H1N1病毒载量、TLR3、p-IκBα蛋白表达及p-TAK1/TAK1、p-NF-κB p65/NF-κB p65比值降低(P<005,P<001),IκBα蛋白表达升高(P<005,P<001)。结论壮宣饮可有效降低促炎细胞因子的释放,减轻H1N1流感病毒性肺炎大鼠的肺损伤,其作用机制可能与抑制TLR3/TAK1/NF-κB信号通路有关。

基于TLR4/TAK1/NF-κB途径探讨MCAO大鼠缺血局部脑皮质微血管新生的内在机制

目的 探讨Toll样受体4/转化生长因子(TGF)-β激活激酶1/核因子(TLR4/TAK1/NF)-κB途径对大脑中动脉栓塞(MCAO)大鼠缺血局部脑皮质微血管新生的内在机制。方法 将40只雄性SD大鼠随机分为假手术(Sham)组、模型(Model)组、阴性病毒(NC)组和siRNA-TLR4转染(siRNA-TLR4)组各10只,除Sham组外,其余各组均采用线栓法建立MCAO大鼠模型,造模后1h假手术组与模型组均给予尾静脉注射等量生理盐水,阴性病毒组给予尾静脉注射阴性对照病毒,siRNA-TLR4转染组给予尾静脉注射siRNA-TLR4腺病毒。苏木精-伊红(HE)染色观察缺血局部脑皮质病理变化;氯化三苯基四氮唑(TTC)染色检测脑梗死面积;末端DNA转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色检测大鼠缺血局部脑皮质细胞凋亡情况;免疫荧光染色检测微血管内皮细胞数目;免疫组化法检测血管内皮生长因子(VEGF)、Ang-1、促血管生成素(Ang)-2表达水平;逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测TLR4、转化生长因子(TGF)-β、TAK1、NF-κB p65 mRNA表达水平;Western印迹检测TLR4、TAK1和NF-κB p65蛋白表达。结果 沉默TLR4表达可改善脑组织损伤程度,明显降低脑梗死面积和脑皮质细胞凋亡率(P<0.01,P<0.05),明显促进脑皮质微血管内皮细胞(BMECs)增殖(P<0.05),明显上调血管新生相关因子VEGF、Ang-1和Ang-2表达(P<0.05),明显下调TLR4、TAK1、NF-κB p65 mRNA和蛋白表达水平(P<0.05)。结论 TLR4/TAK1/NF-κB途径通过增加缺血局部脑皮质新生血管形成,从而改善脑缺血对脑组织的损伤。

光照与温度对拟南芥tak基因表达与LHC磷酸化的影响

TAK1和TAK2是拟南芥核基因编码的蛋白激酶,TAK1可能参与植物状态转换中LHCⅡ蛋白磷酸化的调控.根据TAK1蛋白序列,合成了一段含12个氨基酸残基的亲水短肽,与牛血清白蛋白(BSA)偶联并免疫家兔得到TAK1抗体.经免疫双扩散和蛋白质印迹检测,该多肽抗体效价和特异性较高.借助TAK1抗体以及磷酸化抗体进行杂交试验,结合特异引物进行半定量PCR,研究了光照与温度对拟南芥tak1和tak2基因表达的影响.结果表明,光强与温度调节LHCⅡ蛋白磷酸化,也会在转录水平和蛋白质水平上影响tak1和tak2基因表达.LHCⅡ蛋白磷酸化对光响应趋势与TAK1蛋白水平变化相同.此外,低光照促进tak2基因表达,tak2基因转录表达受温度的影响较小.tak1和tak2基因表达调控方式不同,可能与启动子响应元件的不同相关.

TAK免疫增强剂对奶牛乳房炎的疗效观察

根据临床症状及应用亚临床乳房炎快速诊断试验检出试验用奶牛。将确诊的泌乳期临床乳房炎奶牛 10头设为 A组 ,干奶期临床乳房炎奶牛 8头设为 B组 ,泌乳期隐性乳房炎奶牛 18头设为 C组 ,C组中另设肌肉注射组 (肌注组 6头 )、乳房注射组 (乳注组 6头 )及对照组 (6头 )。用 TAK免疫增强剂进行治疗试验 ,A,B组的给药途径为肌肉注射 ,每次每头 10 m L / d;C组肌注组给药方法同 A,B组 ,乳注组在每个患病奶牛乳区注射 ,剂量为每乳每区 10 m L / d。临床乳房炎治愈效果以患病奶牛临床症状消失作为主要指标 ,隐性乳房炎奶牛采用称量法测定每头奶牛不同时期的日均泌乳量 ,并用 BMT诊断液检测治疗效果。治疗试验结果表明 ,TAK免疫增强剂对临床乳房炎特别是泌乳期临床乳房炎奶牛治愈率达 80 % ,对干奶期奶牛治愈率为 37.5 % ,对隐性乳房炎奶牛也有较好的疗效 ,尤其可使肌注组奶牛产奶量明显增加 ,且肌注组和乳注组乳头阳性率分别比治疗前下降了 2 1.6 %和16 .7%。

半滑舌鳎TRAF6基因和TAK1基因的克隆及表达分析

本研究通过同源克隆和RACE技术获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)和转化生长因子β激活激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1)的c DNA全长,并分析了其在不同组织和早期胚胎发育时期的表达情况。结果表明,TRAF6 c DNA全长1956 bp,开放阅读框(ORF)为1731 bp,编码576个氨基酸。二级结构预测显示TRAF6具有保守的蛋白结构域:N端的RING结构,两个锌指结构以及C端的环–环(coiled-coil)α螺旋结构和高度保守的MATH同源结构。TAK1 c DNA全长2519 bp,ORF为1731 bp,编码576个氨基酸。TAK1的蛋白结构域包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶激活结构域和C端的环–环(coiled-coil)α螺旋结构域。系统进化树分析表明,半滑舌鳎TRAF6和TAK1分别与牙鲆(Paralichthys olivaceus)TRAF6和TAK1聚为一支,亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,TRAF6和TAK1在所检测的8种组织中都有表达,TRAF6在鳃中的表达最高,肠中也有较高的表达;TAK1在心脏中的表达量最高,其次是肾。TRAF6和TAK1在鳃、肾等免疫器官中的高表达,与其在Toll样受体信号通路中的重要作用是一致的。对TRAF6和TAK1在早期胚胎发育时期的表达情况进行检测,结果显示,在未受精卵中可检测到TRAF6和TAK1,提示了这两种免疫分子的母源性m RNA遗传的可能性。免疫分子母源性m RNA可能参与发育过程,也可能参与构建免疫体系,以保护胚胎或仔鱼免受病原体的侵袭。

拟南芥TAK蛋白激酶的结构预测与功能分析

TAK1、TAK2和TAK3属于TAK蛋白激酶家族,由拟南芥核基因编码,其中TAK1参与了主要捕光色素复合物LHCⅡ蛋白磷酸化调控与光系统的状态转移.本文使用生物信息学手段对TAK1、TAK2和TAK3蛋白进行了较为系统的分析,发现TAK1、TAK2和TAK3为单次跨膜蛋白,具有保守的激酶活性域、疏水性强的N端跨越类囊体膜、亲水性高的C端处于基质中等特点.在PDB中找到了不少与TAK1、TAK2和TAK3同源性大于30%的蛋白序列,其中大部分也带有酪氨酸激酶保守域,使用同源建模的方法,建立了拟南芥蛋白激酶TAKs核心结构域的三维结构,围绕蛋白激酶的结构和作用机制关系进行了探讨,设计出多肽抗体,并进行蛋白印迹检测抗体的专一性,为TAKs蛋白激酶进一步的功能研究奠定了基础.

TLR4抑制剂TAK-242对高脂饮食诱导的小鼠胰岛素抵抗的干预作用

目的建立高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠模型,探讨干预Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)对高脂饮食诱导的小鼠胰岛素抵抗状态的影响。方法首先建立高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠模型。选取出生21 d的雄性C57BL/6小鼠36只,随机分为2组,正常对照组12只,以普通基础饲料喂养(low fat diet,LFD),高脂饮食实验组24只,给予高脂饲料喂养(high fat diet,HFD)。待2组小鼠体质量出现显著差异时,进行葡萄糖耐量实验(glucose tolerance test,GTT)和胰岛素耐量实验(insulin tolerance test,ITT)观察小鼠胰岛素抵抗的发生。小鼠胰岛素抵抗模型建立后,观察TLR4抑制剂TAK-242对小鼠胰岛素抵抗状态的作用。LFD组小鼠继续以基础饲料喂养(即作LFD对照组);HFD组小鼠随机分为2组,每组12只小鼠,均继续以高脂饲料喂养,其中一组HFD小鼠腹腔注射TLR4抑制剂TAK-242,以0.5 mg TAK-242/kg体质量的计量给予,每周2次(即给予TAK-242的高脂饮食实验组,HFD-T组);另一组HFD小鼠作为单纯高脂饮食的胰岛素抵抗空白对照组(HFD-C组),只给予等体积的溶媒-二甲基亚砜(DMSO)。给予小鼠TLR4抑制剂5个月,进行GTT和ITT后,处死小鼠。采用EDTA-K2抗凝管收集血液标本,立即分离外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)和血浆。应用Western blot技术检测PBMC TLR4蛋白表达水平。采用全自动生化分析仪测定血浆葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)的水平。结果在小鼠胰岛素抵抗模型建立期间,与对照组相比,高脂饮食组小鼠体质量增长较快,喂养至第20周体质量出现显著差异(P<0.05);持续高脂饮食7个月,GTT和ITT结果显示,高脂饮食组小鼠对糖的调节能力受损、对胰岛素的降糖作用减低,说明高脂饮食诱导小鼠胰岛素抵抗成功。出现胰岛素抵抗的小鼠,在给予TLR4抑制剂TAK-242 5个月后,对葡萄糖的调节能力和对胰岛素的敏感性均有所改善。血浆生化指标结果显示,与对照组比较,单纯高脂组和给予TAK-242的高脂饮食干预组小鼠血浆TG、TC、LDL-C浓度均显著升高(P<0.05),GLU、HDL-C、ALT水平均有升高趋势,但无统计学意义(P>0.05)。单纯高脂组和TAK-242干预组比较,血浆GLU、TG、TC、LDL-C、HDL-C、ALT水平在2组之间不存在显著性差异(P>0.05)。Western blot实验结果发现,正常对照组小鼠PBMC未见TLR4蛋白表达,单纯高脂饮食组小鼠PBMC有高水平的TLR4蛋白表达,给予TAK-242的高脂饮食小鼠PBMC TLR4蛋白虽有表达,但表达量明显低于单纯高脂饮食组小鼠,结果提示TAK-242部分抑制了高脂饮食喂养小鼠PBMC TLR4蛋白的表达。结论高脂饮食成功诱导了小鼠产生胰岛素抵抗,抑制TLR4蛋白的表达可以改善小鼠胰岛素抵抗状态。该研究结果丰富了胰岛素抵抗发生的机制,为进一步深入研究TLR4及其信号通路在胰岛素抵抗中的作用提供了实验依据。

TAK-242对糖尿病周围神经痛大鼠的治疗作用

目的明确HMGB1-TLR4轴在糖尿病周围神经痛(DPN)致病过程中的作用及机制,为新型靶向药物治疗的临床研究提供动物实验基础。方法 60只SD大鼠随机分为NC组、DPN组、TAK组。NC组按大鼠体重腹腔注射55 mg/kg柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液,DPN腹腔注射55 mg/kg链脲佐菌素溶液造模,TAK组腹腔注射3 mg/kg TAK-242对大鼠进行行为学分析以及刺激实验,包括热辐射刺激、冷板试验以及触觉过敏试验。采用Western blot方法检测DPN大鼠模型脊髓组织的HMGB1-TLR4轴上下游基因(HMGB1、TLR4、MAPK、NF-κB、IL-6)的变化,分析上述细胞因子表达水平与大鼠疼痛行为的相关性。观察TAK-242对DPN大鼠模型的治疗效果。结果 DPN组大鼠热辐射、冷刺激反应以及机械性触觉异位性疼痛阈值均较NC组下降(P<0.05)。Western blot检测显示DPN组大鼠HMGB1、TLR4、NF-κB、IL-6蛋白表达量较NC组升高(P<0.05);TAK组TLR4、NF-κB、IL-6表达较DPN组下降(P<0.05)。结论 TLR4抑制剂TAK-242通过阻断HMGB1-TLR4轴对DPN动物模型起治疗作用。

ADAMTS-4与TAK1在骨关节炎软骨组织中表达的相关性研究

目的探讨带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶-4(ADAMTS-4)与转化生长因子β激活激酶1(TAK1)在骨关节炎(OA)软骨组织中的相关性表达。方法采用病例对照研究,分别利用免疫组织化学法和Western blot法检测ADAMTS-4、TAK1在OA组及正常对照组软骨组织中的表达情况,同时研究二者在OA中表达的相关性。结果 ADAMTS-4和TAK1在OA组表达均明显高于正常对照组(P<0.01);二者在OA软骨组织中的表达呈正相关(r=0.469,P<0.05)。结论 ADAMTS-4与OA软骨病变的发生发展密切相关,活化的TAK1可能致OA软骨组织中ADAMTS-4的高表达。TAK1可以作为OA治疗的新靶点。

丙泊酚对小鼠急性肾缺血再灌注损伤的保护作用及TAK1在其中的作用

目的探讨丙泊酚预处理对小鼠急性肾缺血再灌注损伤的保护作用及转化生长因子β激活激酶(TAK1)在其中可能的作用机制。方法健康雄性8~12周龄昆明小鼠84只随机分为7组(n=12),空白对照组(C组)、假手术对照组(S组)、缺血再灌注组(IR组)、缺血再灌注+丙泊酚处理组(IRP组)、缺血再灌注+脂肪乳剂组(IRF组)、缺血再灌注+丙泊酚+TAK1过表达病毒组(IRPT组)、缺血再灌注+丙泊酚+TAK1阴性病毒对照组(IRPTI组)。IR组夹闭小鼠双侧肾动脉30 min后重新恢复血供,C组不作任何处理,S组仅分离双侧肾动脉,IRP组于缺血损伤前30 min予丙泊酚处理,IRPT组于缺血损伤前30 min予丙泊酚及TAK1过表达慢病毒处理,IRF组于缺血损伤前30 min予脂肪乳剂处理,IRPTI组于缺血损伤前30 min予丙泊酚及TAK1阴性慢病毒处理,其余处理均同IR组。I/R后2 d,HE染色观察肾脏病理改变,半定量法统计肾小管病理改变评分,检测小鼠血清尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)水平,Western-blot法检测TAK1蛋白的表达。结果与C组比较,IR组HE染色可观察到肾损害,小鼠肾功能BUN与Cr水平明显升高,TAK1表达上调(P<0.05);与IR组比较,IRP组HE染色肾损害程度减轻,小鼠肾功能BUN与Cr水平降低,TAK1表达下调(P<0.05);与IRP组比较,IRPT组HE染色肾损害程度增加,小鼠肾功能BUN与Cr水平增高,TAK1表达上调(P<0.05)。结论丙泊酚可减轻小鼠急性肾缺血再灌注所致的肾损伤,其机制可能是通过下调TAK1的活化从而达到肾保护作用。

胆碱酯酶抑制剂TAK-147对大鼠空间记忆的作用

目的 :评价一个新的胆碱酯酶抑制剂 TAK- 14 7对大鼠空间学习记忆的作用。方法 :用水迷宫来评价大鼠空间学习记忆 ,用开场实验方法来分析大鼠的自发活动能力。结果 :在学习过程中 ,腹腔内注射东莨菪碱 (0 .4mg/ kg)明显造成了大鼠空间学习记忆障碍 ,延长了其上台潜伏期。腹腔内注射 TAK- 14 7能剂量依赖性地改善东莨菪碱造成的学习障碍 ,在 0 .3和 1.0 mg/ kg的剂量具有显著性意义。在记忆再现过程中 ,由东莨菪碱 (1.5 mg/kg)造成的上台潜伏期延长也分别被 TAK- 14 7(0 .3mg/ kg和 1.0 mg/ kg)和他克林 (3.0 mg/ kg和 5 .0 mg/ kg)明显逆转 ,且 TAK- 14 7的作用强于他克林。在开场实验中 ,TAK- 14 7组与东莨菪碱组或生理盐水组比较 ,自发活动能力没有明显改变。结论 :TAK- 14 7作为一个新的胆碱酯酶抑制剂 ,能明显改善东莨菪碱造成的大鼠空间学习记忆障碍。

TAK1基因沉默对TNF-a诱导的滑膜细胞IL-6、IL-8表达的影响

目的:观察转化生长因子β激活激酶1(TAK1)基因沉默对肿瘤坏死因子a(TNF-a)诱导的滑膜细胞中促炎介质白介素-6(IL-6)和白介素-8(IL-8)表达的影响,以探讨TAK1在类风湿关节炎(RA)发病中的作用。方法:采取脂质体转染方法将TAK1特异性的小干扰RNA(siRNA)和阴性对照RNA(scRNA)导入类风湿关节炎的滑膜成纤维细胞株MH7A细胞,然后分别用20 ng/ml TNF-a刺激后,检测细胞内IL-6、IL-8 mRNA的表达和培养上清中IL-6和IL-8分泌情况以及p38、ERK、JNK、p65磷酸化的水平和抑制性蛋白IκBα的变化情况。结果:siRNATAK1转染72 h后滑膜细胞中TAK mRNA和蛋白表达的平均抑制率分别为75%和55%。siRNA-TAK1转染下调TNF-a诱导状态下IL-6和IL-8的表达,并能抑制p38、JNK、p65磷酸化和增加IκBα水平。结论:TAK1基因沉默能抑制TNF-a诱导的滑膜细胞IL-6、IL-8表达,可能与其抑制JNK和p38MAPK的活化及NF-κB的活化有关。

槲皮素通过抑制TGF-β/TAK1/JNK和TGF-β/Smad2信号通路发挥抗肝纤维化的作用

目的探讨槲皮素抗肝纤维化的潜在作用机制。方法通过腹腔注射10 mg·kg^(-1)二甲基亚硝胺构建大鼠肝纤维化模型,于造模第3周开始灌胃槲皮素(12.5、25、50 mg·kg^(-1))治疗,造模第4周末处死;对肝组织进行HE和胶原染色,检测羟脯氨酸含量;检测肝功能指标和肝纤维化指标的变化;实时定量PCR检测肝星状细胞活化相关因子的表达水平;免疫组织化学法测定肝组织中TGF-β/TAK1/JNK和TGF-β/Smad2信号途径相关蛋白表达水平的变化。采用MTT法和Western blot法检测槲皮素对大鼠肝星状细胞系HSC-T6的增殖的影响以及对TGF-β1诱导的TAK1、JNK、Smad2蛋白磷酸化的抑制作用。结果与模型组相比,槲皮素25和50 mg·kg^(-1)组大鼠肝纤维化程度明显降低;槲皮素(20和40μmol·L^(-1))能显著抑制HSC-T6细胞的增殖,并能有效地降低TGF-β/TAK1/JNK和TGF-β/Smad2信号途径相关蛋白磷酸化程度。结论槲皮素可通过调节TGF-β/TAK1/JNK和TGF-β/Smad2信号通路影响肝星状细胞活化以发挥抗肝纤维化作用。

丙泊酚对肾小管上皮细胞系缺血再灌注损伤后纤维化和TAK1的影响

目的探讨丙泊酚对人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)缺血再灌注损伤后纤维化的作用及转化生长因子β激活激酶(TAK1)在其中的可能作用机制。方法采用随机数字表法将HK-2细胞分为6组(n=36):空白对照组(C组)、缺血再灌注组(IR组)、丙泊酚组(IRP组)、脂肪乳剂组(IRF组)、TAK1过表达组(IRPT组)、TAK1过表达阴性病毒对照组(IRPTI组)。采用抗霉素A耗竭HK-2细胞ATP后更换正常培养液恢复补充代谢底物的方法制备ATP耗竭再恢复损伤模型模拟体内细胞缺血再灌注损伤状态。C组正常培养,不作任何处理;IR组:正常培养的HK-2细胞更换为含10μmol/L抗霉素A及1μmol/L钙离子通道载体A23187的无血清DMEM培养基孵育1 h,PBS清洗之后再换成正常含血清培养基继续培养12、24、48 h;IRP组于ATP耗竭前1 h,正常培养基中加入丙泊酚(终浓度20μmol/L)预孵育1 h;IRPT组于正常培养基中加入丙泊酚(终浓度20μmol/L)及TAK1慢病毒(滴度为2×107TU/mL)预孵育1 h;IRF组正常培养基中加入10%脂肪乳剂预孵育1 h;IRPTI组正常培养基中加入丙泊酚(终浓度20μmol/L)及TAK1阴性慢病毒预孵育1 h,其余处理均同IR组。于ATP再恢复12 h时,采用流式细胞仪检测细胞凋亡,MTT法测定细胞活力;于ATP再恢复12、24和48 h时,采用Western blot法测定TAK1的表达水平,于ATP再恢复48 h时Western blot法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维粘连蛋白(FN)、胶原蛋白1(COL 1)的表达水平。结果与C组比较,IR组细胞凋亡率增加,细胞活力降低,ATP再恢复后TAK1、COL1、α-SMA和FN表达均上调(P<0.05);与IR组比较,IRP组细胞凋亡率减少,细胞活力增强,ATP再恢复后TAK1、COL1、α-SMA和FN表达均下调(P<0.05);与IRP组比较,IRPT组细胞凋亡率增加,细胞活力降低,再恢复后TAK1、COL1、α-SMA和FN表达均上调(P<0.05)。结论丙泊酚预处理可减轻ATP耗竭再恢复诱导的HK-2细胞纤维化,其机制可能是通过下调TAK1表达,进而抑制了早期细胞凋亡,从而减轻了HK-2细胞纤维化程度。

TAK1抑制剂对高糖环境巨噬细胞和系膜细胞相互作用的影响及机制

目的探讨高糖环境下转化生长因子β激活激酶1(TAK1)抑制剂5Z-7-oxozeaenol在巨噬细胞和系膜细胞相互关系中的作用。方法巨噬细胞和系膜细胞共培养、巨噬细胞单培养、系膜细胞单培养3种培养方式分别分为:抑制剂对照组、甘露醇对照组、正常对照组、高糖组、高糖+不同浓度(30、100、300 nmol/L)抑制剂组。采用Western blot法检测单培养巨噬细胞p-TAK1、TAK1结合蛋白(TAB1)、NF-κB p65蛋白表达变化,免疫荧光检测TAK1抑制剂对NF-κB p65亚基核转位的影响。采用ELISA法检测单培养和共培养各组细胞上清液中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β、单核细胞趋化因子(MCP)-1、Ⅳ型胶原(ColⅣ)、纤维连接蛋白(FN)含量变化,光镜下观察共培养对巨噬细胞迁移能力影响。结果与对照组比较,高糖刺激巨噬细胞pTAK1、TAB1、NF-κB p65蛋白表达均明显上调(P<0.05),高糖组共培养和单培养细胞上清液中TNF-α、IL-1β、MCP-1、ColⅣ、FN均显著高于对照组(P<0.05),共培养细胞上清液中各种细胞因子含量较单培养升高更明显(P<0.05),与高糖组比较,TAK1抑制剂呈浓度依赖性降低各项指标表达(P<0.05)。300 nmol/L抑制剂明显降低巨噬细胞迁移数目(P<0.05)。结论高糖环境下,巨噬细胞与系膜细胞之间存在相互影响,这种作用能促进炎症因子(TNF-α、IL-1β、MCP-1)和细胞外基质成分(ColⅣ、FN)产生增加,而TAK1抑制剂能通过干预NF-κB p65核转位,抑制巨噬细胞迁移,减少炎症因子和细胞外基质成分的分泌,发挥抗炎、抗纤维化效应,从而起到肾脏保护作用。

金欣口服液对RSV感染BALB/c小鼠肺组织TLR4及TAK1表达的调控作用

目的通过观察金欣口服液(炙麻黄、苦杏仁、生石膏、黄芩等)对呼吸道合胞病毒(RSV)感染肺组织TOLL样受体4(TLR4)及转化生长因子β活化激酶(TAK1)表达的调控趋势,探讨金欣口服液抗病毒机制以及TLR4信号通路途径。方法 RSV滴鼻感染BALB/c小鼠,金欣口服液给药进行干预,并于首次滴鼻后24 h取各组小鼠肺组织,Western Blot法检测小鼠肺组织TLR4、TAK1蛋白表达。结果 RSV感染BALB/c小鼠后24h,TLR4﹑TAK1蛋白表达明显升高(P<0.01),而金欣口服液组较RSV感染组TLR4﹑TAK1表达明显下调(P<0.01);金欣组蛋白表达量最低,与利巴韦林组相比,P<0.01,利巴韦林组与RSV感染组相比P<0.01。结论金欣口服液能抑制TLR4信号转导通路中TLR4/TAK1蛋白的表达,TLR4的蛋白表达与TAK1的蛋白表达呈正相关,金欣口服液抗RSV作用机制中的TLR4信号通路途径可能是通过TAK1实现的。