TAK242干预早期LPS诱导小鼠急性呼吸窘迫综合征的机制研究

目的探究Toll样受体4信号抑制剂TAK242对脂多糖(LPS)诱导的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)小鼠的治疗干预机制。方法采用LPS诱导建立小鼠ARDS模型,HE染色观察小鼠肺组织形态结构改变,取45只小鼠随机分成对照组、ARDS组及TAK242+ARDS组,每组15只。采用荧光定量PCR检测及Western blot检测各组小鼠肺组织中Toll样受体4(TLR4)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)mRNA及蛋白表达变化。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠肺灌洗液中TNF-α、IL-6含量变化。结果与对照组小鼠相比,ARDS小鼠肺泡及间质组织发生病变,组织炎症浸润明显,小鼠肺组织TLR4、TNF-α、IL-6 mRNA及蛋白表达明显高于对照组(P<0.05),肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6含量明显升高。给予TAK242治疗后,肺组织中TLR4、TNF-α、IL-6mRNA及蛋白表达及肺泡灌洗液中含量均较ARDS组小鼠明显降低(P<0.05)。结论 TAK242诱导小鼠肺组织中TLR4表达下降,并抑制相关炎症因子表达,可能成为TAK242抑制LPS诱导ARDS小鼠的机制之一。

TAK242阻断Toll样受体4通路在脓毒症中对肝脏起到保护作用

目的探讨Toll样受体4(TLR4)特异性抑制剂TAK242对脓毒症大鼠模型肝脏的保护机制。方法将18只雄性SD大鼠按随机数字表法分为3组,每组6只,采用腹腔注射脂多糖(LPS)15 mg/kg制备脓毒症模型;TAK242干预组于制模前腹腔注射TAK242(5 mg/kg)进行预处理,脓毒症模型组和对照组则注射等量溶剂〔10%二甲基亚砜(DMSO)+90%玉米油〕。6 h后取大鼠腹主动脉血,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组大鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平;处死大鼠取肝组织,采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测各组大鼠肝组织TLR4、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)、核转录因子-κB p65及其磷酸化(NF-κB p65,p-NF-κB p65)的表达水平,采用免疫组织化学(免疫组化)染色观察肝组织NF-κB p65蛋白表达,采用苏木素-伊红(HE)染色评估肝细胞损伤情况。结果脓毒症模型组ALT和AST水平均较对照组显著升高〔ALT(μg/L):26.639±7.814比2.847±2.150,AST(μg/L):28.442±8.417比5.779±3.019,均P<0.01〕,TAK242干预组ALT和AST水平则较脓毒症模型组明显降低〔ALT(μg/L):7.269±3.398比26.639±7.814,AST(μg/L):3.580±3.115比28.442±8.417,均P<0.01〕。光镜下显示,脓毒症模型组肝细胞排列紊乱,细胞水肿明显,炎症细胞浸润增多;TAK242干预组肝细胞排列整齐,肝细胞水肿明显减轻,炎症细胞浸润减少。Western blotting结果显示,脓毒症模型组肝组织caspase-3蛋白表达较对照组明显升高(caspase-3/GAPDH:0.794±0.164比0.482±0.055,P<0.05),TAK242干预组caspase-3蛋白表达则较脓毒症模型组明显降低(caspase-3/GAPDH:0.482±0.056比0.794±0.164,P<0.05),说明TAK242可减轻脓毒症大鼠肝脏细胞凋亡。脓毒症模型组肝组织IL-6、TNF-α和TLR4蛋白表达及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均明显高于对照组(IL-6/GAPDH:1.442±0.204比1.019±0.024,TNF-α/GAPDH:1.089±0.098比0.806±0.005,TLR4/GAPDH:1.292±0.085比0.941±0.087,p-NF-κB p65/NF-κB p65比值:1.936±0.081比1.579±0.183,均P<0.05),TAK242干预组肝组织IL-6、TNF-α和TLR4蛋白表达及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均较脓毒症模型组明显降低(IL-6/GAPDH:1.035±0.042比1.442±0.204,TNF-α/GAPDH:0.572±0.096比1.089±0.098,TLR4/GAPDH:0.984±0.078比1.292±0.085,p-NF-κB p65/NF-κB p65比值:1.484±0.255比1.936±0.081,均P<0.05),说明LPS诱导的脓毒症可激活肝组织TLR4/NF-κB通路所介导的炎症反应,给予TAK242阻断TLR4通路后,TLR4/NF-κB通路的激活被抑制,从而减轻脓毒症大鼠肝组织的炎症反应。免疫组化染色显示,脓毒症模型组肝组织NF-κB p65阳性表达较对照组明显增加;TAK242干预组NF-κB p65阳性表达则较脓毒症模型组明显减少,细胞核内几乎无阳性表达。结论TAK242通过阻断肝脏TLR4/NF-κB通路可减轻脓毒症大鼠的肝功能损伤,起到保护肝脏的作用。

TAK242阻断TLR4通路起到对脓毒性心肌损伤和心功能障碍的保护作用

目的探讨Toll样受体4(TLR4)通路在脓毒症大鼠心肌损伤和心功能障碍中的作用。方法将18只雄性SD大鼠按照随机数字表法分为对照组、脂多糖(LPS)组和TLR4特异性抑制剂TAK242预处理组(TAK242+LPS组),每组6只。通过腹腔注射LPS 15 mg/kg诱导脓毒性心脏功能障碍大鼠模型;对照组给予等量生理盐水。TAK242+LPS组在给予LPS刺激前3 h腹腔注射3 mg/kg TAK242〔以0.2 g/L溶于10%二甲基亚砜(DMSO)+90%玉米油中〕;对照组和LPS组给予等量10%DMSO+90%玉米油。注射LPS后14 h采用心脏多普勒超声检查各组大鼠心功能。取腹主动脉血,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清心肌肌钙蛋白(cTn)水平。取心肌组织,苏木素-伊红(HE)染色后,光镜下观察大鼠心肌组织形态学改变;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测心肌组织中白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA表达;采用免疫组化法观察心肌组织中TLR4的表达;采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测心肌组织中TLR4、核转录因子-κB p65(NF-κB p65)及其磷酸化(p-NF-κB p65)水平。结果①心功能及心肌损伤:心脏多普勒超声显示,LPS组大鼠左室舒张期末容积(LVEDV)、左室收缩期末容积(LVESV)明显高于对照组,左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)明显低于对照组;光镜下可见心肌细胞变性坏死和炎性细胞浸润,且血清cTn水平均较对照组明显升高,说明LPS诱导的脓毒症可引起心功能障碍和心肌损伤。而给予TAK242预处理阻断TLR4通路对脓毒症时的心功能和心肌有保护作用,表现为TAK242+LPS组LVEDV和LVESV均较LPS组明显降低〔LVEDV(μL):71.25±21.16比118.01±11.89,LVESV(μL):9.57±5.75比32.70±9.22,均P<0.01〕,LVEF、LVFS较LPS组明显升高〔LVEF:0.868±0.075比0.722±0.095,LVFS:(59.88±8.46)%比(42.37±8.71)%,均P<0.05〕,心肌组织损伤明显减轻,且血清cTn水平较LPS组明显降低(μg/L:107.85±21.38比152.25±27.46,P<0.05)。②炎症指标:qPCR、Western blotting及免疫组化显示,LPS组大鼠心肌组织中IL-6和TNF-α的mRNA表达、TLR4蛋白表达及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均明显高于对照组,说明LPS诱导的脓毒症可激活心肌组织中TLR4/NF-κB通路介导的炎症反应。给予TAK242阻断TLR4通路可抑制TLR4/NF-κB通路,从而减轻脓毒症大鼠心肌组织炎症反应,表现为TAK242+LPS组心肌组织IL-6和TNF-α的mRNA表达、TLR4蛋白表达及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均较LPS组明显降低〔IL-6 mRNA(2^(-ΔΔCT)):10.44±3.30比107.50±29.48,TNF-αmRNA(2^(-ΔΔCT)):2.38±0.68比3.77±0.56,TLR4蛋白(TLR4/GAPDH):0.39±0.01比0.58±0.04,p-NF-κB p65/NF-κB p65比值:1.21±0.11比2.10±0.18,均P<0.05〕。结论TAK242可通过阻断TLR4信号通路介导的炎症反应来保护LPS诱导的脓毒性心功能障碍和心肌损伤。

Toll样受体4特异性抑制剂TAK242对假体周围骨溶解的研究

目的探讨Toll样受体4(TLR4)特异性抑制剂瑞沙托维(TAK242)对假体周围骨溶解的疗效机制。方法将12只健康成年雄性无特定病原体(SPF)级SD大鼠采用简单随机分组法分成3组,空白组,模型组,TAK242实验组,每组4只。空白组不放置聚乙烯颗粒(PE),模型组,实验组均放置聚乙烯颗粒。空白组、模型组术后7d给予生理盐水腹腔注射。实验组手术7d开始腹腔注射TAK242(药物浓度为2.5mg/ml),剂量5mg/kg,两天1次,共2个月。随后处死动物提取血清,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组骨保护蛋白(OPG),核因子-κB受体活化因子配体(RANKL),并分析OPG/RANKL趋势。用Micro-CT分析假体周围骨质情况,并用苏木精-伊红(HE)染色法和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,分析破骨细胞数量。多样本均数的两两比较采用单因素方差分析。结果ELISA示,TAK242组OPG、OPG/RANKL高于模型组[(557.26±32.74)pg/ml、(19.87±1.58)%比(421.95±14.06)pg/ml、(13.18±0.68)%,F=43.27,P<0.01、F=45.36,P<0.01]。TAK242组RANKL低于模型组[(28.10±1.16)pg/ml比(32.08±1.67)pg/ml,F=11.45,P<0.05]。Micro-CT示,TAK242组BMD、BV/TV、Tb.N高于模型组[(20.71±2.22)g/cm^(2)、(7.69±0.85)%(0.78±0.09)1/mm比(13.73±0.54)g/cm^(2),(5.02±0.18)%、(0.53±0.07)1/mm,F=37.14,P<0.01、F=37.84,P<0.01、F=17.94,P<0.01]。TAK242组Tb.Pf低于模型组[(13.63±1.66)1/mm比(17.07±1.53)1/mm,F=9.29,P<0.05]。TAK242实验组HE染色较模型组比,骨小梁数量、厚度增高,磨损颗粒诱导的骨质吸收区域变小,炎性浸润较对照组减少。TAK242实验组TRAP染色较模型组比少量破骨细胞浸润,炎性细胞浸润少。结论TLR4特异性抑制剂TAK242有效抑制假体周围骨溶解。

基于TLR4/MyD88/TRIF通路探讨芪参合剂对耐药肺炎克雷伯菌脓毒症大鼠的固有免疫调节机制

目的:基于TLR4/MyD88/TRIF通路探讨芪参合剂对耐药肺炎克雷伯菌脓毒症大鼠的固有免疫调节机制。方法:将40只SD大鼠随机分成空白组、模型组、芪参合剂组及TAK242组,气管注射耐药肺炎克雷伯菌复制脓毒症大鼠模型,造模后6 h,空白组和模型组灌胃给予生理盐水,芪参合剂组灌胃给予芪参合剂,TAK242组腹腔注射给予TAK242,1次/d,干预3 d后收集标本,检测BALF炎症因子水平及血清生化指标。RT-PCR、Western blot及免疫组化方法观察芪参合剂对肺组织中TLR4、MyD88、TRIF、NF-κB p65 mRNA和蛋白表达的影响,ELISA法观察芪参合剂对肺组织中TNF-α、IL-6、MIP-2、CXCL1水平的影响。结果:与空白组相比,模型组大鼠BALF中TNF-α、IL-6水平及血清生化指标明显升高(P<0.05),肺组织中TLR4、MyD88、TRIF、NF-κB p65 mRNA及蛋白水平明显升高(P<0.05),肺组织中炎症因子(TNF-α、IL-6、MIP-2、CXCL1)水平明显升高(P<0.05)。芪参合剂和TAK242均可显著下调TLR4信号通路中TLR4、MyD88、TRIF、NF-κB p65 mRNA和蛋白水平(P<0.05),同时显著下调炎症因子(TNF-α、IL-6、MIP-2、CXCL1)水平(P<0.05)。结论:芪参合剂和TAK242作用效果相似,均可显著下调TLR4信号通路中TLR4、MyD88、TRIF、NF-κB p65的蛋白水平和mRNA水平,减轻炎症因子释放,从分子生物学水平阐明了芪参合剂的固有免疫调节机制可能与抑制TLR4信号通路的过度活化有关。

Toll样受体⁃4抑制剂TAK⁃242对大鼠重度牙周炎骨吸收的影响

目的探讨Toll样受体⁃4(Toll like receptor⁃4,TLR⁃4)抑制剂TAK⁃242对大鼠重度牙周炎骨质吸收的影响,为重度牙周炎寻找辅助治疗手段提供实验基础。方法18只3周龄雄性Wistar大鼠随机分为3组(n=6),其中1组为正常对照组,另外2组以含有牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)ATCC33277的5⁃0丝线结扎大鼠双侧上颌磨牙行重度牙周炎建模,分为牙周炎组、TAK⁃242组;TAK⁃242组从丝线结扎第1天起,通过尾静脉隔天注射1次溶于DMSO的TAK⁃242(2 mg/kg),另外两组注射相同体质量比例的DMSO溶剂,连续8周;第8周末处死3组大鼠,获取大鼠上颌骨标本,采用micro⁃CT扫描后三维重建,测量特定位点釉牙骨质界⁃牙槽嵴顶的距离评估骨丧失量,并对牙槽骨骨质相关参数和骨质微结构进行分析;组织学切片苏木精⁃伊(HE)染色观察牙周组织病理改变;甲基绿染色观察牙槽骨吸收情况;抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察破骨细胞分布情况。结果Micro⁃CT定量分析显示:牙周炎组与TAK⁃242组牙槽骨吸收显著高于对照组;与牙周炎组相比,TAK⁃242组大鼠上颌第一磨牙近、远中根吸收位点的骨丧失均显著减轻(P<0.001),骨密度(P<0.05)与骨体积/总体积分数(P<0.01)显著增高,骨小梁数目与骨小梁厚度(P<0.01)相对增多,骨小梁分离度(P<0.01)和骨小梁结构模式指数显著降低。牙周炎组骨质呈现疏松多孔的蜂窝状结构,骨小梁结构恶化,向杆状结构转变;TAK⁃242组骨质微结构改善,骨量改善,骨小梁分布相对更致密,骨小梁结构与对照组更相似。HE染色发现牙周炎组与TAK⁃242组牙周附着丧失与牙槽骨吸收较对照组显著;与牙周炎组相比,甲基绿染色表明TAK⁃242组骨吸收减轻,TRAP染色显示破骨细胞浸润减少(P<0.001)。结论TLR⁃4抑制剂TAK⁃242能缓解大鼠重度牙周炎骨吸收,改善其多孔、稀疏、排列紊乱的炎症性骨小梁结构。