KRT6A调控胰腺导管腺癌细胞生物学行为的作用及作为诊断与预后判断靶标的研究

目的:通过生物信息学分析以及细胞生物学实验研究角蛋白6A(KRT6A)对胰腺导管腺癌(PDAC)诊断、预后判断、免疫微环境以及PDAC细胞PANC1增殖、凋亡等生物学行为的影响。方法:通过GEPIA平台整合TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库与GTEx(Genotype-Tissue)数据库中的数据,分析KTRT6A在PDAC组织中的表达情况,并通过CIBERSORT工具分析KRT6A表达与PDAC组织中免疫细胞浸润的关系,然后通过GSEA方法研究与KRT6A基因表达相关的肿瘤信号通路。选取长海医院病理科保存的60例PDAC组织与癌旁组织标本进行免疫组化分析,验证KRT6A在肿瘤组织中表达情况;通过干扰RNA敲减PANC1细胞中KRT6A的表达,采用CCK-8实验以及流式细胞术检测敲减KRT6A对细胞的增殖、凋亡的影响。结果:利用TCGA与GTEx数据库数据分析发现,KRT6A在人PDAC组织中呈高表达,且与患者较差的生存期存在关联(P=0.015)。利用CIBERSORT软件以及GSEA分析发现,KRT6A高表达的PDAC组织中M2型巨噬细胞浸润性升高(P=0.034),且与Wnt通路(NES:1.7359272,P<0.05)、磷酸戊糖途径(PPP)(NES:1.5613053,P<0.05)等信号通路上调有关联(P<0.05或P<0.01);免疫组化结果进一步验证了KRT6A在PDAC组织中呈高表达(P<0.001)。增殖和凋亡实验发现,干扰KRT6A能够显著抑制PANC1细胞的增殖(P<0.05)以及凋亡(P<0.001)。结论:KRT6A在人PDAC组织中呈高表达,敲减其表达能够抑制PANC1细胞的增殖和凋亡,具有作为PDAC诊断与预后判断新靶标的潜力。

Bmi-1基因诱导人胰腺导管上皮细胞恶性转化

目的探讨原癌基因B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1(Bmi-1)过表达对人正常胰腺上皮细胞株h TERT-HPNE恶性转化的影响。方法采用逆转录病毒介导转染方法将携带原癌基因Bmi-1的质粒或空质粒稳定转染h TERT-HPNE,通过Real-time PCR及Western blot在m RNA及蛋白水平鉴定转染效果。采用MTS法、Traswell小室法、软琼脂克隆形成试验检测稳定转染Bmi-1对h TERT-HPNE细胞增殖、迁移、侵袭和软琼脂克隆形成能力的影响。结果 Real-time PCR及Western blot结果均表明成功建立稳定转染Bmi-1基因的h TERT-HPNE细胞株。过表达Bmi-1基因使h TERT-HPNE细胞增殖、迁移、侵袭和软琼脂克隆形成能力明显增高。结论在细胞水平过表达Bmi-1基因恶性转化h TERT-HPNE细胞。

Notch3通过TGFβ1信号通路参与调节小鼠胰腺星状细胞的激活

目的:探讨Notch3在小鼠胰腺星状细胞(pancreatic stellate cells,PSCs)激活中的作用机制。方法:原代分离培养小鼠PSCs并用油红O染色鉴定,细胞分组为空白对照组、阴性对照siRNA组、Notch3 siRNA组、转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGFβ1)组及Notch3 siRNA+TGFβ1组。应用RNA测序检测Notch3基因对其他信号通路的影响;应用免疫组织化学检测Notch3与TGFβ1在人胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcino⁃ma,PDAC)间质及癌旁组织中的表达情况;应用免疫荧光双标法检测Notch3和TGFβ1在PDAC间质的共表达情况;应用Western blot检测Notch3和TGFβ1在空白对照组和Notch3 siRNA组小鼠PSCs中的表达;应用Western blot检测Notch3基因敲减和TGFβ1诱导对活化的PSCs中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、纤连蛋白(fibronectin)和I型胶原(collagen type I,Col I)蛋白表达的影响;应用划痕实验和CCK-8实验检测Notch3基因敲减和TGFβ1诱导对小鼠PSCs迁移和活力的影响。结果:RNA测序和Western blot结果显示,敲减小鼠PSCs中Notch3基因表达可抑制TGFB1基因和TGFβ1蛋白表达;免疫组化和免疫荧光双标染色结果显示,Notch3和TGFβ1共表达于人PDAC间质细胞中;与Notch3 siRNA组相比,Notch3 siRNA+TGFβ1组小鼠PSCs中fibronectin和Col I蛋白表达显著升高(P<0.05),且PSCs活力和迁移能力显著提高(P<0.01)。结论:抑制小鼠PSCs中Notch3基因的表达,同时给予TGFβ1诱导,可提高小鼠PSCs的迁移能力和活力。Notch3对PSCs激活的调节作用部分依赖TGFβ1信号通路。

MiR-30a-5p靶向成纤维蛋白-1抑制胰腺导管腺癌增殖和迁移作用

目的 探讨microRNA-30a-5p (miR-30a-5p)对胰腺导管腺癌(PDAC)细胞增殖和迁移的影响及对成纤维细胞活化蛋白-1 (FAP-1)的调控作用。方法 反转录聚合酶链反应、免疫印迹法分别检测PDAC细胞及胰腺正常细胞中miR-30a-5p和FAP-1的表达。生物信息学网站预测miR-30a-5p、FAP-1基因存在结合位点,FAP-1在正常细胞与癌细胞表达存在差异;miR-30a-5p模拟物、抑制物,阴性对照物转染PDAC细胞系,反转录聚合酶链反应检测转染效率,蛋白质印迹法检测FAP-1的蛋白表达水平;CCK-8法检测PDAC细胞的增殖;划痕实验、细胞迁移实验检测PDAC细胞的迁移作用。结果 MiR-30a-5p在胰腺正常细胞系中的表达高于PDAC细胞系(P<0.05);FAP-1在胰腺正常细胞系中的表达低于PDAC细胞系(P <0.05)。MiR-30a-5p、FAP-1基因有连接位点,转染miR-30a-5p模拟物后miR-30a-5p表达量增高,FAP-1的表达量显著降低(P <0.05),PDAC细胞的增殖和迁移能力下降(P <0.05);转染miR-30a-5p抑制物后miR-30a-5p表达量降低,FAP-1的表达量显著增加(P <0.05),PDAC细胞增殖和迁移能力增强(P <0.05)。FAP-1、miR-30a-5p与胰腺癌患者临床病理特征之间的关系表明:FAP-1与肿瘤TNM分期相关,FAP-1与饮酒习惯相关;miR-30a-5p与肿瘤TNM分期相关(P <0.05)。结论 MiR-30a-5p可能靶向抑制FAP-1蛋白,抑制PDAC增殖、迁移。

TGF-β上调胰腺导管腺癌微管相关蛋白MAP1S的表达和自噬流

自噬是细胞重复利用错误折叠/聚集的蛋白质或功能失调的细胞器（如受损的线粒体）的自我调节过程。作为神经元细胞特有的MAP1A和MAP1B的同源物,微管相关蛋白MAP1S（最初被称为C19ORF5）广泛分布于机体内,最初曾与自噬的标志物微管相关蛋白1轻链3（light chain 3,LC3）一起被分离。

重编程胰腺导管细胞可成功治疗糖尿病小鼠

在糖尿病的发生发展中,胰岛β细胞功能的进行性丧失最终会导致高血糖的恶化和各种并发症的发生。近期,科学家们找到一种治疗1型糖尿病的策略——通过重编程小鼠体内的胰腺导管细胞,成功治疗遗传和化学诱发的糖尿病。相关研究于2018年5月2日发表在《Molecular Therapy》杂志上。

雄激素受体通过微小RNA-9-5p/N-my下游调节基因1通路促进胰腺导管腺癌细胞侵袭的机制研究

目的探讨AR如何通过调控微小RNA(miRNA,miR)-9-5p和N-myc下游调节基因1(NDRG1)通路,从而影响胰腺导管腺癌(PDAC)细胞的侵袭。方法对PDAC组织和相应非肿瘤组织样本的分析。我们通过在PDAC细胞系PANC-1、BxPC-3细胞中过表达或敲低AR,用Transwell方法观察AR对PANC-1、BxPC-3及侵袭的影响。通过生信分析寻找能够调控靶基因NDRG1表达的miRNA,并用定量聚合酶链反应(qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)验证该miRNA与NDRG1的调控关系,观察其对PANC-1、BxPC-3细胞侵袭的影响。通过转染miR-9-5p和NDRG1等基因来评估对PANC-1、BxPC-3细胞侵袭能力的影响,采用t检验比较各组间差异。结果相对于载体对照细胞(PANC-1、BxPC-3-Ctrl),过表达AR促进了PDAC细胞(PANC-1、BxPC-3-oeAR)的PDAC细胞侵袭(0.65±0.07比2.11±0.52、0.74±0.05比2.28±0.65),差异有统计学意义(t=21.160、10.120,P<0.05)。相对对照细胞(PANC-1、BxPC-3-Scr),敲除AR抑制了PDAC细胞的侵袭(PANC-1-shAR、BxPC-3-shAR)(0.75±0.12比0.34±0.02、0.84±0.13比0.44±0.03)差异有统计学意义(t=45.117、13.155,P<0.01)。miR-9-5p模拟物能显著抑制AR过表达PDAC细胞PANC-1、BxPC-3的侵袭能力(0.67±0.06比2.25±0.22、0.88±0.07比2.07±0.32,t=15.124、8.156,P<0.05),而miR-9-5p抑制剂则能增强对照组细胞的侵袭能力(1.64±0.23比0.75±0.09、1.48±0.26比0.84±0.15,t=11.143、9.175,P<0.05)。PDAC组织里,miR-9-5p的产量明显低于正常胰腺组织(0.23±0.02比1.58±0.57,t=8.122,P<0.05)。利用双荧光素酶基因报告实验,我们更深入地肯定了miR-9-5p直接影响NDRG1的3’非翻译区(3’UTR),以此压低其表达。miR-9-5p的过表达显著降低了NDRG1蛋白水平(0.76±0.04比0.42±0.22,t=7.143、11.106,P<0.05),而miR-9-5p的抑制剂则提高了NDRG1蛋白表达(0.46±0.02比1.22±0.26,t=6.121、15.106,P<0.05)。oeAR显著增加了NDRG1的表达(0.37±0.02比1.56±0.45,t=8.197、8.996,P<0.05),而AR的抑制则减少了NDRG1的表达(0.66±0.05比0.22±0.04,t=11.751、6.196,P<0.05)。过表达NDRG1显著抑制PDAC细胞的侵袭能力(1.13±0.12比0.42±0.06,t=5.175、7.776,P<0.05)。NDRG1敲除PDAC细胞侵袭能力显著升高(0.56±0.06比1.36±0.27,t=16.151、17.135,P<0.01)。结论雄激素受体通过miR-9-5p/NDRG1通路抑制PDAC细胞侵袭的机制,为PDAC的治疗提供治疗策略。

CYP2J2介导生成的EETs通过PPARγ促进胰腺导管腺癌铁死亡抵抗

目的:胰腺导管腺癌是消化系统的恶性肿瘤,预后差,复发率高。最新研究表明铁死亡抵抗是胰腺导管腺癌的病理机制之一,但发生铁死亡抵抗的潜在机制尚未阐明。细胞色素P4502J2(CYP2J2)是人体组织细胞中介导花生四烯酸生成环氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids,EETs)的关键酶。研究显示EETs参与肿瘤的发生发展,然而EETs在胰腺导管腺癌中的作用及其对铁死亡的影响尚不清楚。本研究探讨CYP2J2及EETs对铁死亡诱导剂erastin诱导的胰腺导管腺癌铁死亡的影响及其机制。方法:收集9例胰腺导管癌患者的肿瘤组织及相应的癌旁组织,采用real-time PCR和蛋白质印迹法检测CYP2J2表达,酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测8,9-EET分解产物8,9-碳三烯酸(8,9-dihydroxyeicosatrienoic acids,8,9-DHET)的含量。体外实验以人胰腺导管腺癌细胞系PANC-1为研究对象,采用erastin诱导铁死亡,检测细胞内长链脂酰辅酶A合成酶4(acyl-CoA synthetase 4,ACSL4)的蛋白质水平、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、Fe^(2+)浓度及细胞存活状况。给予8,9-EET预处理,观察其对erastin诱导的PANC-1细胞铁死亡的影响。采用慢病毒构建CYP2J2敲低的细胞系,观察其对erastin诱导的PANC-1细胞铁死亡的影响。采用过氧化物酶体增殖激活受体γ(peroxisome proliferation-activated receptorγ,PPARγ)阻断剂处理,观察其对8,9-EET调节erastin诱导的PANC-1细胞谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)和MDA含量的影响。结果:CYP2J2在胰腺导管腺癌组织中高表达,其下游代谢产物8,9-DHET水平亦显著升高。8,9-EET预处理显著减少erastin诱导的PANC-1细胞铁死亡,同时降低PANC-1细胞中Fe^(2+)浓度、LDH活性、MDA含量及ACSL4蛋白质表达。此外,8,9-EET可部分恢复膜铁转运蛋白(ferroportin,FPN)和铁死亡抑制蛋白(ferroptosis suppressor protein 1,FSP1)的基因表达。shCYP2J2能够加剧erastin诱导的PANC-1细胞铁死亡,下调FPN和FSP1的基因表达。GPX4的表达,该效应可被PPARγ阻断剂GW9662消除。结论:CYP2J2/EETs高表达于胰腺导管腺癌组织,EETs通过激活PPARγ上调GPX4的水平,抑制铁死亡,从而促进胰腺导管腺癌铁死亡抵抗。

纳米刀消融联合程序性死亡蛋白-1/程序性死亡蛋白配体-1治疗胰腺癌及其免疫学机制研究进展

胰腺癌特殊的肿瘤微环境不利于免疫治疗,而纳米刀消融可在一定程度上逆转免疫抑制,使其成为目前唯一适用于胰腺癌的消融治疗方法。动物研究结果证实,纳米刀消融联合程序性死亡蛋白-1(PD-1)/程序性死亡蛋白配体-1(PD-L1)治疗胰腺癌可延长患者生存时间。本文对纳米刀消融联合PD-1/PD-L1治疗胰腺癌及其免疫学机制研究进展进行综述。

胰液中黏蛋白1水平对胰腺良恶性疾病的诊断价值

目的评价胰液中黏蛋白1(MUC1)水平对胰腺良恶性疾病的诊断价值。方法选取2014年10月至2017年1月该院肝胆胰脾科收治的70例胰腺疾病患者作为研究对象。其中恶性胰腺疾病患者39例,包括PDAC 34例(PDAC组)和IPMC 5例(IPMC组);良性胰腺疾病患者31例,包括IPMN 19例(IPMN组)和胰腺炎性病变12例(炎性病变组)。各组均进行胰液细胞学检查(PJC)和胰液MUC1水平测定,分析PJC和MUC1联合检测对胰腺良恶性疾病的诊断价值。结果PDAC组和IPMN组患者胰液中MUC1水平均高于炎性病变组,差异均有统计学意义(P<0.05)。受试者工作特征(ROC)曲线分析显示,PJC、MUC1联合诊断胰腺良恶性疾病的灵敏度、特异度和准确度分别为97.4%、96.8%、97.1%。结论胰液中MUC1水平对PDAC诊断的准确度较高,MUC1水平与PJC联合检测可有效提高胰腺良恶性疾病的诊断效能。

人成纤维细胞生长因子1-Ⅲb受体亚型在胰腺导管细胞增殖中的作用及对蛋白激酶的调节

目的探讨人类成纤维细胞生长因子受体1的Ⅲb亚型（FGFR1-Ⅲb）在TAKA-1胰腺导管细胞增殖中的作用及对有丝分裂激活的蛋白激酶（MAPK）的调节。方法以脂质体法将人类全长FGFR1-Ⅲb表达质粒pSVK4／FGFR1-Ⅲb稳定转染入TAKA-1胰腺导管细胞，采用Western印迹、Northern印迹、免疫荧光和糖基化分析等方法鉴定FGFR1-Ⅲb在TAKA-1细胞中的表达、分布和结构特征，并以生长因子刺激转染细胞，通过MTY法及MAPK分析，观察FGFR1-HIb受体在胰腺导管细胞中的功能及作用机理。结果FGFR1-Ⅲb受体是位于120000和130～150000之间的糖基化受体，在细胞膜表面和胞浆中为中等强度表达，在胞浆的核周围区为高表达，细胞核内不表达。FGF-1、-2和-4能够明显促进转染FGFR1-Ⅲb基因的TAKA-1细胞的生长，同时能够明显增强p44／p42MAPK的磷酸化。结论人类FGFR1-Ⅲb受体在胰腺导管细胞中为功能性受体，FGF-1、-2和4能够促进转染FGFR1-Ⅲb基因的TAKA-1细胞的增殖，其机制为促进p44／p42MAPK的磷酸化。

大鼠胰腺次全切除后导管细胞同源盒基因-1表达规律研究

目的 研究大鼠胰腺大部分切除术后,残余胰腺导管上皮细胞转录因子胰-十二指肠同源盒基因(PDX)-1表达规律,探讨PDX-1表达的意义。方法手术切除大鼠胰腺约90％组织,不同时间点处死动物后取材,解剖显微镜下游离胰腺导管,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)与Western blot检测导管上皮中PDX-1 mRNA和蛋白表达。结果实验组手术后第2天与第3天导管上皮细胞PDX-1蛋白表达显著升高,高于对照组两倍以上,与对照组比较差异有显著性(P<0.05),第5天到第7天逐渐恢复到对照组水平;实验组在各时间点PDX-1 mRNA表达水平与对照组无明显差异(P>0.05)。结论残余胰腺再生过程中导管上皮细胞中出现PDX-1高表达,表明胰腺干细胞参与残余胰腺再生,且PDX-1表达受转录后调控。

OAS1通过增强mTOR信号通路促进胰腺癌细胞的增殖

目的:探索2',5'-寡腺苷酸合成酶1(2',5'-oligoadenylate synthase 1,OAS1)在胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)中的表达情况、临床意义以及其对PDAC细胞增殖能力的调控作用及潜在机制。方法:利用高通量基因表达数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)和癌症基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)等公共数据库分析OAS1在胰腺癌组织中的表达情况,并通过免疫组织化学染色验证OAS1在PDAC患者组织芯片中的表达情况及其与患者临床预后的相关性;通过实时荧光定量PCR和蛋白质印迹实验检测OAS1mRNA和蛋白质在不同PDAC细胞系中的表达水平;利用siRNA干扰OAS1在Patu-8988与PDC0034细胞系中的表达,随后通过CCK-8实验和克隆形成实验探究OAS1对PDAC细胞增殖能力的影响;通过基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)筛选OAS1调控PDAC的可能机制;利用siRNA干扰OAS1在Patu-8988与PDC0034细胞系中的表达的同时对细胞予以哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路激动剂MHY1485处理,通过测定细胞存活能力和细胞中总胆固醇含量来验证OAS1调控PDAC细胞增殖的潜在分子机制。结果:数据库分析结果提示OAS1在胰腺癌组织中的表达显著上调(P<0.05);PDAC组织芯片的免疫组织化学染色结果显示,相比于配对的癌旁正常组织,OAS1在肿瘤组织中的表达水平明显上调,且其高表达与患者的不良预后呈正相关(P<0.05);实时荧光定量PCR和蛋白质印迹实验结果显示,OAS1在PDAC细胞中的表达水平普遍高于正常胰腺导管细胞;进一步在Patu-8988与PDC0034细胞系中干扰OAS1表达后,PDAC细胞的增殖能力显著下降(P<0.001)。GSEA结果提示OAS1可能通过影响mTOR信号通路和胆固醇稳态相关通路来影响PDAC细胞的增殖;干扰OAS1表达后,PDAC细胞中的mTOR信号通路可能被抑制且细胞的胆固醇含量下降,用mTOR信号通路激动剂MHY1485处理细胞可部分逆转OAS1干扰造成的增殖抑制和胆固醇减少。结论:OAS1在PDAC组织和细胞中高表达且与患者的不良预后相关,OAS1可能通过促进mTOR信号通路的激活调节胰腺癌细胞的胆固醇代谢,进而促进胰腺癌细胞的增殖功能。

PDX-1促进大鼠胰腺导管上皮细胞向胰岛细胞分化的研究

胰岛移植是治疗Ⅰ型糖尿病的有效手段，但胰岛来源的不足限制了胰岛移植的临床应用。我们采用含PDX-1（蟾蜍同系物XIHbox8）的真核表达载体体外转染大鼠胰腺导管上皮细胞，诱导其分化为胰岛β细胞，探讨外源性PDX-1在胰腺导管上皮细胞向β细胞定向分化中的作用。

微RNA-19a与胰腺癌预后的关系及其对胰腺癌PANC-1细胞药物灵敏性的影响

胰腺癌是致死率极高的消化系统恶性肿瘤，其发病率逐年上升，严重威胁人类健康。胰腺导管腺癌（ pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC） 是胰腺癌最常见的病理类型，占80％～90％；PDAC由于症状隐匿，发现时多处于晚期，总体预后较差，中位生存时间仅为3～5个月，1年生存率〈10％。CA19-9是美国FDA唯一批准的PDAC生物标志物，但其筛选力差。随着对胰腺癌研究的不断深入，大量预后标志物被发现，但均处于研究阶段，未被临床推广使用。

细小病毒H-1抗肿瘤作用的研究进展

细小病毒（PV）在感染人体后没有明显症状，将其用于抗肿瘤治疗获得了较好的疗效。H-1PV对于多形性胶质母细胞瘤（GBM）、伯基特淋巴瘤、肝癌、胰腺导管腺癌（PDAC）、乳腺癌、结肠癌都有治疗效果，其抗肿瘤作用主要通过直接溶瘤活性、NS1蛋白和免疫调节实现。