大肠杆菌表达的TaqDNA聚合酶的纯化

Taq DNA聚合酶是分子生物学研究中最常用的热稳定DNA聚合酶之一,与其他热稳定DNA聚合酶具有相似的特征,其纯化策略不但有潜在的应用前景,也对同类聚合酶的分离具有指导意义。已报道的适宜大量制备Taq酶的方案所需成本较高,而文章介绍了一种利用国产阳离子交换树脂廉价制备Taq酶的方案。在本方案中,采用热变性、(NH4)SO4沉淀与724离子交换层析分离大肠杆菌表达的Taq酶,约18 g Na型树脂干粉一次可回收比活约8 131.98 U/mg、总酶活2.2×105U、近27.07 mg Taq酶。纯化的产率可达48.92%,纯化倍数约59.35。所制酶SDS-PAGE电泳只检测到94 kDa单一蛋白条带,未检测到DNA核酸酶污染,与商品酶的PCR扩增能力无区别。此纯化方法成本低,适合实验室一般性的制备和生产应用。

利用Taq DNA聚合酶反转录cDNA第一链的研究

应用ＴａｑＤＮＡ聚合酶（ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）直接对ＲＮＡ进行反转录成ｃＤＮＡ第一链，然后用特异引物进行ＰＣＲ扩增，结果表明，反转录达到ＡＭＶ逆转录酶的效果，且可能得到比ＡＭＶ逆转录酶更完整的ｃＤＮＡ第一链。

快速纯化高活力基因工程Taq DNA聚合酶

用含有TaqDNA聚合酶基因的 pTaq表达质粒转化E .coliDH5α菌株 ,IPTG诱导表达TaqDNA聚合酶 .利用该酶的热稳定性 ,经两轮 - 70℃深度冷冻和 75℃水浴 ,细菌裂解释放内容物 ,以高速离心除去冻融变性的细胞碎片及核酸蛋白的复合物以达到快速纯化TaqDNA聚合酶的目的 .PCR扩增反应表明所制备的TaqDNA聚合酶的活力、敏感性、特异性均达到试验要求 .该方法具有快速简便的优点 .

普通Taq DNA聚合酶扩增幽门螺杆菌尿素酶基因长片段

ＰＣＲ反应扩增较长的ＤＮＡ片段比较困难。本实验对幽门螺杆菌染色体ＤＮＡ上的２７Ｋｂ尿素酶基因用普通ＴａｑＤＮＡ聚合酶进行扩增，扩增结果以琼脂糖凝胶电泳证实，得到所需的２７Ｋｂ的片段。该实验为今后幽门螺杆菌工作的进一步研究提供了经济，有效，简捷的条件。

Taq DNA聚合酶制备技术的优化

以酶蛋白表达量、酶活性和比活性为指标 ,从工程菌菌株、转化方法、诱导表达时间、诱导剂浓度 4个方面 ,对TaqDNA聚合酶制备技术进行了优化筛选。用JM 1 0 9菌株制备的总酶活力高于DH5α ,电击法的转化率高于热激法 ,用 1 0mmol/LIPTG诱导 1 2h ,酶蛋白表达量、酶活性和比活性均显著高于其他浓度和时间的处理。SDS PAGE电泳和PCR扩增结果表明 ,用优化技术制备的TaqDNA聚合酶 ,纯度、酶活力和特异性均达到分子生物学实验的要求 。

DNA聚合酶对PCR方法检测基因点突变的干扰分析

以野生型斑马鱼p53基因外显子7为目的片段,运用变性高效液相色谱(DHPLC),比较分析三种常用的商品DNA聚合酶对聚合酶链式反应(PCR)技术检测基因点突变的影响.DHPLC检测结果显示,Pro-mega Shanghai公司Taq DNA聚合酶,Promega公司Taq DNA聚合酶和BD Biosciences公司高保真酶Advan-tage-HF2的分子突变频率分别为14.3%,5.95%和0.76%.通过DNA直接测序法确认表明,Promega公司Taq DNA聚合酶和BD Biosciences公司高保真酶Advantage-HF2的碱基突变频率分别为3.61×10-4和7.69×10-5.研究表明,不同的DNA聚合酶对PCR技术的检测结果有明显影响,高保真酶Advantage-HF2所造成的碱基错配率明显低于其它两种商业化Taq酶.

一种利用Taq酶快速标记DNA探针的方法

目的 :探索低成本、高效、快速的DNA探针标记方法。方法 :以特定引物和 16mer的随机引物作为延伸引物 ,利用Taq酶标记DNA探针。以大肠杆菌Klenow片断随机引物延伸标记法作为对照。点杂交方法检测探针标记效果。结果与结论 :Taq酶标记法和大肠杆菌Klenow片段随机引物延伸标记法同样有较好的标记效果 ,且随机引物或特定引物作为延伸引物均可以合成足够有效的探针。Taq酶标记法是一种低成本、高效。

乌拉尔甘草ISSR-PCR反应体系优化研究

甘草是中国最大宗的药材之一,具有重要的药用、生态及工业价值。利用ISSR技术对甘草种质资源的遗传多样性进行深入研究,对甘草物种生物多样性的保护及新品种培育具有重要意义。研究了影响甘草ISSR-PCR扩增效果的一些因素,实验结果表明:最适宜用于甘草ISSR+PCR分析的反应条件为:20μl反应体系中,1×TaqDNA聚合酶配套缓冲液(10mmol/LTris-HCL,pH9.0,50mmol/LKCL,0.1%TritonX_100,2.0mmol/LMg2+),0.8UnitTaqDNA聚合酶,0.4μmol/L引物,200μmol/LdNTP,10ng模板DNA。

小麦雄性不育材料RAPD扩增体系研究

以光敏雄性不育系A31及其恢复系1376为材料,使用美国MGREACHE公司生产的PTC-200型PCR,对影响RAPD扩增的因素进行了比较研究,确定了模板、Mg2+、dNTPs、引物和TapDNA聚合酶的适宜浓度和最佳的循环次数,实验结果表明在25μL反应体系中使用20～40ng的模板DNA,1.5～2.0mmol/L的Mg2+,0.3～0.4mmol/L的dNTPs,0.15～0.20μmol/L随机引物,1.0～1.5单位TaqDNA聚合酶;反应条件为94℃预变性5min,然后进行94℃45s,36°45s,72°90s,45个循环后,再在72℃延伸10min,小麦雄性不育材料RAPD扩增效果较好。

三丙二酸富勒烯对DNA限制性内切酶和Taq DNA聚合酶活性的抑制作用

采用具有HindⅢ和EcoRⅠ单一酶切位点的pEGFP-N1超螺旋型质粒为底物,检测三丙二酸富勒烯(trimalonic acid C60,TMA C60)对DNA限制性酶切反应的作用.同时以该质粒为模板,测定TMA C60对Taq DNA聚合酶催化的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的影响.酶切产物与PCR扩增产物均通过琼脂糖凝胶电泳来显示.实验发现,在质粒酶切体系或PCR体系中添加TMA C60后,酶切或扩增产物的生成量均显著减少.TMA C60的作用存在浓度依赖性,对HindⅢ,EcoRⅠ两种酶切反应和PCR的半抑制浓度IC50值分别为16.3,6.0,6.0μmol/L.两种活性氧清除剂L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁和叠氮化钠在浓度为2～10mmol/L时,不能拮抗TMA C60对PCR和两种酶切反应的抑制作用.但是,在PCR体系中增加Taq DNA聚合酶能够拮抗TMA C60的作用.这些结果表明,TMA C60能够抑制上述3种DNA代谢相关酶的活性,其作用可能与活性氧无关.

橄榄基因组DNA提取及RAPD扩增条件优化

以橄榄叶片为材料,进行橄榄基因组DNA提取及RAPD扩增条件优化。试验表明,采用改良的SDS法,提取的DNA质量较高,适宜于RAPD分析。在25μL反应体积中,RAPD反应的优化体系为:18.5μLddH2O,0.5μLdNTP,2.5μlBuffer,1μL引物,0.5μLDNA模板,2μLTaqDNA聚合酶。

RAPD标记在油菜隐性核不育两亲及杂种纯度检验上的应用研究(Ⅱ)——反应体系的优化构建

以隐性核不育双低杂交油菜黔油12号父母本及其杂交种为材料,对影响油菜RAPD分析的主要因素进行系统的比较研究,试验结果表明,25.0μl反应体系中,最佳的组成是:10倍Buffer,2.0mmol/L的MgCl2,0.2mmol/L的dNTPs,0.7μmol/L的引物,1.5U的TaqDNA聚合酶以及50.0ng的模板DNA。

如何解除PCR反应中的抑制现象

多种因素均能影响 PCR反应的顺利进行 ,尤其是菌体中的各种杂蛋白以及在模板提取过程中混入的各种化学试剂 ,对 Taq DNA聚合酶均有很强的抑制作用 .本文以扩增细菌的 1 6Sr DNA为例 ,说明了这些成分对 PCR的抑制 ,同时提出了克服不利因素的方法 .

濒危植物刺桫椤RAPD反应体系的优化

以高盐 SDS法提取濒危植物刺桫椤 ( Alsophila spinulosa)嫩叶总 DNA,进行 RAPD分析 ,分别研究了模板 DNA、引物、 d NTP、 Mg2 + 和 Taq DNA聚合酶用量以及反应体积对反应结果的影响 .筛选并建立了适合于刺桫椤 RAPD扩增的反应体系 :反应体积 1 0 μL,内含 2 ng/ μL模板 DNA,2 .0 mmol/ L Mg Cl2 ,0 .3μmol/ L引物 ,30 0μmol/ L d NTP,0 .5 u Taq DNA聚合酶 .

板栗RAPD影响因素的研究

稳定的 RAPD反应体系是进行 RAPD分析的关键。分别测试了模板 DNA、d NTP、Mg2 +、引物、Taq DNA聚合酶浓度和变性时间、退火温度及时间、延伸时间、循环次数等对反应结果的影响。通过实验确定了板栗最佳的 RAPD反应条件。在 5 0 μl反应体系中含有 5 0 ng模板、0 .74μmol/L随机引物、180 μmol/L d NTP、3 U Taq DNA聚合酶、2 .0 mmo1/LMg Cl2 。反应扩增程序为 :94℃预变性5 min,40次热循环 ,每个循环包括 :94℃变性 3 0 sec,3 6℃退火 45 sec,72℃延伸 90 sec,最后 72℃终延伸 7min。按照优化的 RAPD条件进行的重复实验 ,重现性良好。

大白菜RAPD扩增体系的优化研究

以大白菜 341 1 - 7自交系为材料 ,使用 PE公司生产的 Thermal Cycler480型 PCR仪 ,对影响大白菜 RAPD扩增的因素进行了研究 ,确定了模板 ,Mg2 +,d NTPs,引物和 Taq DNA聚合酶的适宜浓度和最佳的循环次数 .实验结果表明 ,在 2 5μL反应体系中使用 2 0— 60 ng的模板 DNA,1 .5— 2 .0 mmol/L 的 Mg2 +,0 .1 5— 0 .2 5 mmol/L d NTPs,0 .8— 1 .0 μmol/L随机引物 ,1 .0— 1 .5 U Taq DNA聚合酶 ;在 94℃下预变性 5 min后执行 94℃ 1 min,37℃ 1min,72℃ 2 min,35个循环 ,最后 72℃再延伸 5 min的条件下 ,大白菜的

Construction of Vectors to Express Foreign Protein within Potato Starch Grains

[Objective] The aim is to study the construction of vectors expressing foreign protein in potato starch grains specifically, and provide some reference for solving industrialized core problem of high cost and low expression level of foreign protein. [Method] By using molecular biological techniques of RT-PCR and nested PCR, plant expression vector for the foreign protein locating in the potato starch grains was constructed. [ Result] Coding sequence （ GC20 ） of potato starch grains that was located and expressed by GBSSI promoter was cloned. Plant expression vector was screened out through connection, transformation and enzyme digestion identification. [ Conclusion] This result laid a foundation for further screening the foreign protein on the potato starch grains.

川山茶ISSR-PCR及SSR-PCR优化体系建立及比较

以川山茶品种"茶睡莲"为试验材料,以改良CTAB法提取高质量DNA,采用正交设计L16(45),探讨了Mg^(2+)、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶和模板DNA浓度对川山茶ISSR-PCR和SSR-PCR反应体系的影响。建立了相关优化体系:20μL的ISSR-PCR扩增体系中含20 ng模板DNA,2μL10×Buffer,2 mmol/L Mg^(2+),0.15 mmol/L dNTPs,0.6μmol/L引物和1 U TaqDNA聚合酶,扩增退火温度为55℃,35个循环;20μL的SSR-PCR扩增体系中含50 ng模板DNA,2.5 mmol/L Mg^(2+),0.05 mmol/L dNTPs,0.2μmol/L引物和0.5 U TaqDNA聚合酶,最佳退火温度为52℃,最佳循环数为38。应用该优化体系,分别用27个川山茶品种DNA进行了ISSR-PCR扩增和SSR-PCR扩增,结果显示,建立的优化体系具有较高稳定性。

PCR技术在茶树害虫研究中的应用展望

聚合酶链式反应（PCR）是一种根据生物体内DNA复制的特点而设计的在体外对特定DNA序列进行快速扩增的新技术。随着重复多轮DNA合成技术的进步与具热稳定性的TaqDNA聚合酶的发现和应用，PCR技术不断完善，尤其是自动化PCR仪的设计成功，使PCR技术的操作程序大大简化，目前在分子生物学及其相关学科中已得到广泛应用，尤其在昆虫学研究中发展相当迅速。PCR技术可以应用到茶树害虫研究的许多方面，不久的将来，PCR技术也将成为我国茶树害虫研究的常用方法之一。